楊小燕 黃朝暉 劉方 夏作勛 賴運(yùn)波

腹膜透析(PD)已成為終末期腎病(ESRD)的一種主要腎臟替代治療方式[1-2]。長期PD使腹膜組織暴露于腹膜透析液中，腹膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，使腹膜向纖維化轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腹膜超濾功能和轉(zhuǎn)運(yùn)功能衰竭。保持腹膜的完整性是目前PD治療的重要挑戰(zhàn)。對腹膜纖維化(PF)的防治被認(rèn)為是提高PD患者遠(yuǎn)期預(yù)后的主要措施之一[3]。微小RNA-21(miR-21)是一種內(nèi)源性的非編碼小分子，在轉(zhuǎn)錄后與信使RNA結(jié)合調(diào)控多種基因表達(dá)[4]，與藥物性腎損傷、糖尿病腎病和腎臟纖維化等病理生理過程密切相關(guān)[5-7]。大蒜素是從百合科蔥屬植物大蒜中提取的有效成分，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤等藥理作用[8]。大蒜素在各種疾病中均能發(fā)揮功效，如口腔黏膜纖維化[9]、腎臟纖維化[10]等，不良反應(yīng)較少，但其用于治療長期PD導(dǎo)致PF的報(bào)道較小。因此，本文通過探討大蒜素對葡萄糖氯己定誘導(dǎo)大鼠PF的影響及其機(jī)制，為今后研發(fā)治療手段提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料：實(shí)驗(yàn)動物：SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，體重(260±20)g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2015-030。實(shí)驗(yàn)藥物：大蒜素軟膠囊(H65020369)購于新疆華世丹藥業(yè)有限公司。膠原蛋白Ⅲ(Col Ⅲ)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、Smad7、磷酸化-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)和羊抗兔二抗均購于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。大鼠總RNA提取試劑盒(RE-03014)購于Foregene公司；Bulge-LoopTMmiRNA引物(R10031.7)、Bulge-LoopTM實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒均購于銳博生物。實(shí)驗(yàn)儀器：BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)、Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)、PIKORed 96 RT-PCR儀、Thermo Scientific Piko Real分析軟件(美國Thermo Fisher儀器有限公司)。

2.方法

(1)實(shí)驗(yàn)分組及處理：將30只大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組與大蒜素組，每組10只。造模與藥物干預(yù)條件：模型組與大蒜素組大鼠以10 ml/kg的濃度腹腔注射0.1%葡萄糖氯己定溶液，空白組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，每天1次，持續(xù)21 d后停止腹腔注射，造模完畢。大蒜素組大鼠于實(shí)驗(yàn)開始給予大蒜素溶液22 mg/kg灌胃，每天1次，空白組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，總共持續(xù)12周。

(2)大鼠PF測定：造模12周后處死所有大鼠，收集其壁層腹膜。采用蘇木素-伊紅(HE)與馬松(Masson)染色觀察大鼠腹膜組織病理情況，評價(jià)腹膜組織損傷及纖維化程度。采用圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的面積與視野面積，計(jì)算纖維率。纖維率(%)=視野面積(mm2)/圖像面積(mm2)×100%。

(3)免疫組化法檢測腹膜組織中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2的表達(dá)水平：將固定好的腹膜組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、氧化、封閉，置于Col Ⅲ(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)、TGF-β1(1∶1 000)、Smad7(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)一抗中4 ℃孵育過夜，漂洗3遍后，在室溫中孵育二抗2 h，再經(jīng)過顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明，封片后，采用顯微攝像系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再選取3個(gè)視野分別采集400倍顯微圖像，采集全部圖像的光密度和面積，并計(jì)算每張圖像的平均光密度，選取3張圖像的平均光密度計(jì)算每例樣本的平均光密度。

(4)RT-PCR檢測大鼠腹膜組織中miR-21的表達(dá)水平：根據(jù)試劑盒說明書對各組腹膜組織進(jìn)行RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄后，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用軟件分析PCR過程各檢測樣本的CT值，采用2-△△CT值反映相對miRNA表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.3組大鼠病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：大蒜素干預(yù)12周后HE染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組腹膜組織明顯增厚，可見肌纖維表面大量纖維組織增生，核多呈卵圓形或長橢圓形，部分結(jié)締組織壞死明顯，周圍可見數(shù)量不等的中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，大蒜素組腹膜組織增厚減輕，成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤減少。Masson染色結(jié)果顯示，與空白組[(2.937±1.776)%]比較，模型組[(34.380±3.783)%]、大蒜素組[(11.710±6.087)%]大鼠纖維率明顯提高(P<0.05)；與模型組比較，大蒜素組大鼠纖維率明顯降低(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 3組大鼠腹膜組織HE染色結(jié)果(A、B、C：×100；D、E、F：×400)：A、D：空白組；B、E：模型組，可見纖維組織增生，炎性細(xì)胞聚集，如箭頭所示；C、F：大蒜素組

圖2 3組大鼠腹膜組織Masson染色結(jié)果(×400)：A：空白組；B：模型組；C：大蒜素組

2.3組大鼠腹膜組織中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2表達(dá)水平比較：與空白組比較，模型組腹膜組織中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，大蒜素組腹膜組織中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 3組大鼠腹膜組織中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2的表達(dá)(免疫組化染色，×400)：A、D、G、J、M：空白組；B、E、H、K、N：模型組；C、F、I、L、O：大蒜素組

表1 3組大鼠腹膜組織中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2表達(dá)水平比較

4.3組大鼠腹膜組織中miR-21表達(dá)水平比較:大蒜素干預(yù)12周后，與空白組比較(1.010±0.152)，模型組(1.873±0.306)及大蒜素組(1.433±0.288)大鼠腹膜組織中miR-21表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，大蒜素組miR-21表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

討 論

PF是腹膜長期暴露在高濃度透析液下而引起的一種疾病，其主要的病理特征為腹膜細(xì)胞受損、出現(xiàn)纖維化樣，進(jìn)而影響腹膜主導(dǎo)的各種生理功能。腹膜間皮細(xì)胞在高濃度透析液下，通過增加細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的合成，減少其降解，導(dǎo)致ECM的積累，加快上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，形成纖維化[11]。PF的形成過程十分復(fù)雜，涉及多種通路與信號分子，目前主要的治療手段為改善腹膜透析液生物相容性、西藥、基因與中藥治療，其中中草藥因?yàn)榫邆涠喟悬c(diǎn)、多途徑抗纖維化作用的優(yōu)點(diǎn)，因此發(fā)掘中藥-靶基因的治療模式成為研究熱點(diǎn)[12]。

組織纖維化的特點(diǎn)之一是纖維膠原合成增多，纖維組織在HE與Masson染色下會體現(xiàn)出來，同時(shí)組織中Col Ⅲ和α-SMA的蛋白含量也會升高[13]。有研究結(jié)果表明，大蒜素能通過減輕肝細(xì)胞炎癥與壞死程度，減少膠原蛋白的生成，恢復(fù)肝小葉組織結(jié)構(gòu)，達(dá)到緩解肝臟纖維化的效果[14]。本研究使用大蒜素進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，腹膜組織中炎性細(xì)胞聚集減少，纖維組織與膠原生成減少，Col Ⅲ、α-SMA表達(dá)水平降低，說明大蒜素能減緩PF程度，但是其干預(yù)機(jī)制尚未明確。

MiR是一種長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其中的miR-21被認(rèn)為是致癌與致纖維化的關(guān)鍵。miR-21可調(diào)控TGF-β1的表達(dá)，直接影響TGF-β1下游介導(dǎo)的一系列通路，如TGF-β1/Smad纖維化通路和ERK通路[15]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-21過表達(dá)后，可導(dǎo)致TGF-β1-Smad2/3信號通路激活，促進(jìn)肝纖維化的形成[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組miR-21的表達(dá)水平明顯升高，與既往研究結(jié)果一致[17]，而大蒜素干預(yù)后miR-21的表達(dá)水平下降，初步說明大蒜素干預(yù)產(chǎn)生了抑制miR-21表達(dá)的作用，但尚未確定通過干預(yù)下游何種通路產(chǎn)生抗纖維化作用。

TGF-β1是誘導(dǎo)纖維化的因子之一，纖維化組織中TGF-β1的表達(dá)水平會上升，同時(shí)也會進(jìn)一步激活下游的纖維化通路，如TGF-β1-Smad2/3與ERK通路[18]。因此如何抑制TGF-β1的表達(dá)水平成為治療纖維化的關(guān)鍵。而在TGF-β1-Smad2/3通路中，TGF-β1既可誘導(dǎo)Smad2/3的合成，又能反饋性調(diào)控Smad7的形成，其中Smad2/3是纖維化的主要誘導(dǎo)蛋白，而Smad7可抑制Smad2/3的生成[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確了大蒜素能抑制miR-21的表達(dá)，在對TGF-β1與Smad7的檢測后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠由于miR-21過表達(dá)導(dǎo)致下游的TGF-β1表達(dá)水平上升，而大蒜素組大鼠TGF-β1的表達(dá)水平下降，證明了miR-21可以影響TGF-β1的表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠中Smad7的表達(dá)水平也明顯升高，大蒜素組Smad7的表達(dá)水平降低，猜測其可能出現(xiàn)的原因是因?yàn)門GF-β1主動調(diào)節(jié)與Smad2/3負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致，從側(cè)面印證miR-21能通過TGF-β1-Smad2/3通路介導(dǎo)PF，同時(shí)說明大蒜素能通過抑制該通路而起到減輕纖維化的效果。TGF-β1也能通過Ras-MEKs通路使ERK1/2復(fù)合受體磷酸化，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核發(fā)揮促纖維化的作用[20]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化中，TGF-β1-Smad-ERK1/2信號通路被激活[21]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠TGF-β1與p-ERK1/2表達(dá)水平上升，而大蒜素組的表達(dá)水平下降，說明大蒜素能影響TGF-β1/Smad/ERK信號通路，產(chǎn)生減輕PF的效果。

本研究尚存在局限性：由于PD是人類用于臨床治療腎病的手段，臨床疾病與動物模型之間存在一定的差異，目前對PF動物模型成模的公認(rèn)指標(biāo)尚未完全明確，對評價(jià)某種藥物的療效存在局限性，因此本實(shí)驗(yàn)選擇的葡萄糖氯己定誘導(dǎo)大鼠PF作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，不能完全模擬因PD而產(chǎn)生的PF，只能說明大蒜素在這種動物模型下可產(chǎn)生效果；另一方面，本實(shí)驗(yàn)只選取了其中一個(gè)與PF相關(guān)聯(lián)的miR-21和TGF-β1/Smad/ERK信號通路進(jìn)行研究，因?yàn)門GF-β1/Smad通路與ERK通路之間存在相互影響的關(guān)系，只能間接證明大蒜素能通過抑制miR-21對TGF-β1/Smad及ERK信號通路發(fā)揮作用，并不足以全面闡述大蒜素抑制PF的作用機(jī)制，因此今后我們將會從更多方面去研究大蒜素抑制PF的機(jī)制，使大蒜素的干預(yù)機(jī)制更加明確。

綜上所述，大蒜素能減輕葡萄糖氯己定誘導(dǎo)的大鼠PF，其中一個(gè)干預(yù)機(jī)制可能是通過降低miRNA-21的表達(dá)，抑制TGF-β1/Smad/ERK信號通路上的部分蛋白，發(fā)揮減少纖維膠原合成與纖維組織增生的作用，進(jìn)而減輕PF程度，這為今后的進(jìn)一步研究提供了前期基礎(chǔ)。