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        EGCG對美拉德反應產(chǎn)物抗氧化性能的影響

        2021-03-18 12:06:52郭艷艷
        關(guān)鍵詞:抗氧化性拉德半胱氨酸

        軒 滋,李 華,郭艷艷

        河南工業(yè)大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001

        美拉德反應又稱羰氨反應,是發(fā)生在羰基化合物和氨基化合物之間的非酶褐變反應[1]。美拉德反應會產(chǎn)生還原酮中間體、雜環(huán)化合物和類黑素等美拉德反應產(chǎn)物(MRPs),MRPs不僅對食品的色澤、香味和口味等產(chǎn)生有益影響,還具有很強的抗氧化能力[2-7]。但是,美拉德反應非常復雜,中間反應機制尚未完全澄清,對該反應過程及其產(chǎn)物利用仍需進一步研究。

        食品加工過程中,多種成分間存在相互作用,從而影響產(chǎn)品的品質(zhì)。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從茶葉中提取的一種兒茶素類單體,是茶多酚的主要成分。研究表明,EGCG具有抗氧化活性,可與生育酚和化學合成的丁基化羥基茴香醚(BHA)媲美[8]。EGCG還具有抗炎、降血脂、抗癌等作用,可以替代合成食品添加劑,保證食品的安全和質(zhì)量。此外,EGCG能夠減少美拉德反應有害產(chǎn)物的產(chǎn)生[9]。盡管EGCG在加工和儲存過程中存在不穩(wěn)定性,但是仍有許多食品和飲料中添加EGCG等茶多酚成分,以期延長食品的保質(zhì)期和提高其抗氧化性能。

        基于美拉德反應的復雜性和產(chǎn)物不確定性,目前研究較多的是葡萄糖-氨基酸模型[10],張曉溪等[11]利用果糖和不同氨基酸進行美拉德反應,結(jié)果表明果糖-半胱氨酸美拉德產(chǎn)物的還原能力和ABTS自由基清除能力最高。此外,半胱氨酸還是面筋中的重要氨基酸,探討EGCG對其功能的影響,也有助于面制品的研究。因此,作者選擇葡萄糖-半胱氨酸模型進行試驗,采用DPPH法、ABTS法和總還原能力3種測定方法,考察EGCG添加量、加熱溫度、加熱時間、溶液pH值、羰氨物質(zhì)的量比對葡萄糖-半胱氨酸美拉德反應產(chǎn)物的自由基清除率以及還原能力的影響,確定反應產(chǎn)物抗氧化能力的最適產(chǎn)生條件。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        EGCG:實驗室自制(純度90%);L-半胱氨酸(純度99%)、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(純度96%)、2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(純度98%):上海麥克林生化科技有限公司;其他試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        UV-1600B型紫外可見分光光度計:上海美譜達公司;DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋:北京光明公司; pH計:奧豪斯儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品制備

        用pH 7.4的磷酸緩沖液(PBS)制備等物質(zhì)的量(0.1 mmol)的葡萄糖-半胱氨酸溶液模型,置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。分別考察EGCG添加量、反應溫度、加熱時間、體系pH值、羰氨物質(zhì)的量比等因素對模型產(chǎn)物抗氧化能力的影響。

        1.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

        參照Mariana等[12]的方法,略作修改:移取樣品25 μL與4 mL DPPH溶液(DPPH用甲醇溶解,濃度為0.05 mmol/L),混勻后室溫下避光反應30 min,于波長517 nm處測定吸光度,計算DPPH自由基清除率。平行試驗重復3次。

        式中:A1為25 μL樣品溶液+4.0 mL DPPH工作液的吸光度;A2為25 μL樣品溶液+4.0 mL甲醇的吸光度;A0為25 μL PBS+4.0 mL DPPH工作液的吸光度。

        1.3.3 ABTS自由基清除能力的測定

        參照Thaipong等[13]的方法,稍作修改:分別移取5 mL ABTS溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)混合均勻,室溫避光反應12~16 h得到ABTS工作液(當天使用),然后用無水乙醇逐級稀釋至吸光度為0.70±0.02(734 nm處)。移取樣品10 μL與ABTS工作液12 mL,混勻后室溫避光反應30 min,于波長734 nm處測定吸光度,計算ABTS自由基清除率。平行試驗重復3次。

        式中:A1為10 μL樣品溶液+12.0 mL ABTS工作液的吸光度;A2為10 μL樣品溶液+12.0 mL無水乙醇的吸光度;A0為10 μL PBS +12.0 mL ABTS工作液的吸光度。

        1.3.4 總還原能力測定

        取1.0 mL上述模型樣品溶液于試管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液和2.5 mL 1% 的鐵氰化鉀,混勻后置于50 ℃水浴下反應20 min,冷卻至室溫后再加入2.5 mL 10% 的三氯乙酸,混勻,離心(3 000 r/min)10 min 后取上清液1 mL,加入3 mL 蒸餾水和0.3 mL 0.1% 的三氯化鐵,搖勻后靜置10 min,于波長700 nm處測定吸光度,表示樣品總還原能力,其大小與吸光度成正比。平行試驗重復3次。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        采用SPSS Statistics 25、Origin95對試驗數(shù)據(jù)進行處理、繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 EGCG添加量對反應產(chǎn)物抗氧化性的影響

        移取6組10 mL葡萄糖-半胱氨酸溶液,分別添加不同質(zhì)量(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg)的EGCG,140 ℃下加熱1.0 h后用冰水浴冷卻,測定反應產(chǎn)物的抗氧化能力,結(jié)果如圖1所示。

        圖1 EGCG添加量對反應產(chǎn)物抗氧化能力的影響

        由圖1可知,EGCG的添加能夠顯著增強葡萄糖-半胱氨酸模型產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和總還原能力(P<0.05),這可能是因為EGCG本身具有抗氧化能力與MRPs產(chǎn)生了協(xié)同作用;但是對ABTS的清除率增強不顯著(P>0.05)。MRPs能與ABTS+配對,導致其褪色,降低吸光度。隨著EGCG添加量的增加,3種指標都呈現(xiàn)先升高后平緩的趨勢。考慮到EGCG的成本,選擇1.5 mg為EGCG的最適添加量。

        2.2 加熱時間對反應產(chǎn)物抗氧化性的影響

        移取6組10 mL葡萄糖-半胱氨酸溶液,分別加入EGCG 1.5 mg,在140 ℃下分別加熱0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后用冰水浴冷卻,測定反應產(chǎn)物的抗氧化能力,結(jié)果如圖2所示。

        圖2 加熱時間對反應產(chǎn)物抗氧化能力的影響

        由圖2可知,未加熱樣品的抗氧化能力比加熱0.5 h樣品的高,可能是因為半胱氨酸和EGCG具有很強的抗氧化性,但是EGCG具有熱不穩(wěn)定性,隨著加熱時間延長,結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化,抗氧化性受到影響[14]。加熱時間為1.0 h(1.5 h)時,樣品的ABTS清除率、DPPH清除率、總還原能力分別為94.33%、89.72%、2.617 (99.61%、87.65%、2.439 ),較0.5 h時略有增加,說明樣品產(chǎn)生較多具有很強抗氧化能力的美拉德反應后期產(chǎn)物——類黑精[15]。另外,EGCG的自然氧化產(chǎn)物C-4位與C-8″連接的EGCG二聚化合物1和B-B″環(huán)間氧化的化合物,不同反應條件(如時間、溫度、pH值)下,EGCG主要自然氧化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化[16],但仍然具有一定的抗氧化能力。總體比較而言,各時間點抗氧化性沒有明顯變化,這也說明樣品中的抗氧化成分在反應1.0~1.5 h就能形成,且之后保持比較穩(wěn)定的狀態(tài)。為節(jié)約時間,選擇1.0 h為最適反應時間。

        2.3 加熱溫度對反應產(chǎn)物抗氧化性的影響

        移取6組10 mL葡萄糖-半胱氨酸溶液,加入EGCG 1.5 mg,分別于110、120、130、140、150、160 ℃條件下加熱1.0 h后用冰水浴冷卻,測定反應產(chǎn)物的抗氧化能力,結(jié)果如圖3所示。

        圖3 加熱溫度對反應產(chǎn)物抗氧化能力的影響

        由圖3可知,110~130 ℃時,隨著溫度的升高,3種抗氧化指標明顯增加(P<0.05),在130 ℃時,MRPs的ABTS清除率、DPPH清除率和總還原能力分別為94.25%、84.57%、2.415 ,均達到最大值。而130、140、150 ℃時的3種抗氧化指標變化不明顯(P>0.05),說明在3個溫度下均產(chǎn)生了MRPs,而且數(shù)量基本一致,但是160 ℃時抗氧能力有下降趨勢,這可能是因為高溫會導致還原性物質(zhì)的分解,該結(jié)果與唐杰[17]的報道一致。為減少能源消耗,選擇130 ℃為最適加熱溫度。

        2.4 pH值對反應產(chǎn)物抗氧化性的影響

        稱取6份1.5 mg EGCG、0.1 mmol的半胱氨酸和葡萄糖于10 mL瓶中,分別用pH 2.0、4.0、6.0、7.4、8.0、10.0的緩沖溶液溶解,130 ℃下加熱1.0 h后用冰水浴冷卻,測定反應產(chǎn)物的抗氧化能力,結(jié)果如圖4所示。

        圖4 pH值對反應產(chǎn)物抗氧化能力的影響

        美拉德反應體系的pH值能夠影響美拉德反應的反應速率及阿馬道里重排產(chǎn)物的降解路徑,從而影響最終產(chǎn)物中化合物的種類[18]。堿性條件有利于美拉德和焦糖化反應的非酶褐變反應,而體系中酸度越高,在加熱條件下加熱的游離氨基酸的穩(wěn)定性越高[19]。由圖4可知,pH 2.0~10.0時,ABTS清除率和總還原能力呈先平緩后下降的趨勢,DPPH清除率則呈現(xiàn)先升高再平緩后下降的趨勢,MRPs的抗氧化能力在酸性條件下比在堿性條件下高。這與Martins等[20]的試驗結(jié)果一致, pH 4.8~7.5時,類黑精濃度隨著pH值的增加而增加。多數(shù)食品及加工條件的酸堿度為中性,因此,選擇最適值pH 6.0。

        2.5 羰氨物質(zhì)的量比對反應產(chǎn)物抗氧化性的影響

        稱取不同物質(zhì)的量比的葡萄糖-半胱氨酸(0.25∶1、0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、4∶1),溶于10 mL緩沖液(pH 6.0)中,分別添加1.5 mg EGCG,130 ℃下加熱1.0 h后用冰水浴冷卻,測定反應產(chǎn)物的抗氧化能力,結(jié)果如圖5所示。

        圖5 羰氨物質(zhì)的量比對反應產(chǎn)物抗氧化能力的影響

        由圖5可知,隨著反應體系中葡萄糖含量的增加,樣品抗氧化性大致呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當羰氨物質(zhì)的量比為1.5∶1時,MRPs的抗氧化性最強,其ABTS清除率、DPPH清除率和總還原能力分別為99.86%、84.49%和2.199。這可能是因為過多的氨基會發(fā)生分子內(nèi)脫水縮合形成內(nèi)酰胺,從而使反應體系中氨基的量減少,而葡萄糖含量過高,沒有足夠的氨基與羧基發(fā)生反應,在抗氧化測定時對整個體系起到了稀釋作用,這與趙晶等[21]的試驗結(jié)果一致。為節(jié)約成本,最大程度地利用反應底物,選擇1.5∶1為最適羰氨比。

        3 結(jié)論

        通過ABTS清除率、DPPH清除率和總還原能力的測定,分析了EGCG參與下的不同反應條件對美拉德反應產(chǎn)物抗氧化能力的影響。結(jié)果表明,在EGCG添加量為1.5 mg條件下,隨著羰氨物質(zhì)的量比的增加和加熱溫度的升高,反應產(chǎn)物的抗氧化能力都呈現(xiàn)先升高后平緩(或下降)的趨勢;MRPs在酸性條件下具有更好的抗氧化活性。當反應溫度130 ℃、加熱時間1.0 h、pH 6.0、羰氨物質(zhì)的量比1.5∶1時,在EGCG添加量為1.5 mg時,MRPs具有最佳的抗氧化活性。美拉德反應為食品加工中常見的反應,該結(jié)果為進一步研究MRPs抗氧化成分、EGCG對美拉德反應的影響機理以及MRPs的綜合開發(fā)利用提供了技術(shù)支持和理論指導。

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