韋建開(kāi)，廖長(zhǎng)秀2，陶瑩，劉帥廷

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 百色 533000)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)在全球癌癥死亡率中排名第四，占所有癌癥死亡人數(shù)的8.2%[1]，是我國(guó)發(fā)病率和死亡率相對(duì)較高的惡性腫瘤之一。PLC屬于高度免疫抑制型腫瘤，突變負(fù)荷和免疫原性較高，腫瘤邊緣存在一定數(shù)量的T細(xì)胞浸潤(rùn)，但是腫瘤中心T細(xì)胞的數(shù)量一般較少，且浸潤(rùn)T細(xì)胞常常處于功能耗竭狀態(tài)[2-3]。T細(xì)胞耗竭的主要特征為其表面負(fù)性共刺激分子表達(dá)水平升高，相關(guān)細(xì)胞因子分泌減少和效應(yīng)T細(xì)胞殺傷能力下降，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)免疫逃逸而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，肝癌患者免疫負(fù)性共刺激分子的功能可能與肝癌發(fā)生密切相關(guān)。

淋巴細(xì)胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)分子為重要的負(fù)性共刺激分子之一，多表達(dá)于活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，LAG-3的表達(dá)與PLC有相關(guān)性，且肝癌組織上的表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁組織[4]。在PLC患者TIL中的CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)較外周血淋巴細(xì)胞顯著增高。已有研究報(bào)道肝癌患者其他免疫負(fù)性共刺激分子如細(xì)胞程序性死亡受體-1(programmed death 1，PD-1)、T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與肝癌易感性密切相關(guān)[5-6]，但關(guān)于LAG-3 SNP與肝癌之間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本文收集廣西百色市及其周邊地區(qū)PLC患者及健康對(duì)照者各300例，采用多重PCR及高通量測(cè)序法測(cè)定兩組人群DNA LAG-3 rs1882545等位基因，分析兩組人群LAG-3 rs1882545位點(diǎn)等位基因和基因型分布頻率是否存在差異，以探討LAG-3在肝癌發(fā)生發(fā)展中作用，為肝癌易感人群的篩選提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 查閱病例，收集籍貫為廣西百色市或百色市周邊并且于2018年9月—2020年7月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院的PLC患者300例，其中男性261例，女性39例，年齡為23～75歲，平均年齡為(51.2±11.1)歲，<55歲者191例，≥55歲者109例；同時(shí)收集肝炎項(xiàng)目檢查正常即無(wú)肝炎性感染且AFP、AST、ALT、血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)正常300例為對(duì)照組，其中男性255例，女性45例，年齡為23～82歲，平均年齡為(51.9±9.0)歲，<55歲者184例，≥55歲者116例。兩組對(duì)象在平均年齡、性別、年齡構(gòu)成方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有入選樣本均為互無(wú)血緣關(guān)系的廣西百色市及其周邊人群。根據(jù)知情同意原則，告知患者家屬研究目的及風(fēng)險(xiǎn)等，取得同意并簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)過(guò)右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集外周血2 ml，按試劑盒說(shuō)明采用倍沃醫(yī)學(xué)科技公司血液基因組提取試劑盒(批號(hào)：231101200708)提取外周血白細(xì)胞中的基因組DNA。肝癌組樣本所提取DNA濃度在11.50～338.20 ng/μl之間，對(duì)照組樣本所提取DNA濃度大部分在10.65～349.75 ng/μl之間，提取所得的DNA完整性用瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定，所得DNA樣本均符合送檢要求。

1.2.2 LAG-3 rs1882545基因分型采用多重?cái)U(kuò)增及高通量測(cè)序方法進(jìn)行 設(shè)計(jì)并合成好適合rs1882545 SNP位點(diǎn)的引物，上游引物為：5′-TGAGCCGTCTACATAAAACAGTTGA-3′，下游引物為：5′-GATAATACATCTCCTGAAGGCCAAT-3′。通過(guò)兩步PCR的方法完成目標(biāo)SNP位點(diǎn)序列的擴(kuò)增和兼容Illumina測(cè)序文庫(kù)的制備。第一輪PCR體系如下：DNA模板(10 ng/μl)2 μl、上游(10 μM)和下游引物(10 μM)各1 μl和2×PCR Ready Mix 15 μl(總體積25 μl)(Kapa HiFi Ready Mix)。在PCR儀(BIO-RAD，T100TM)上執(zhí)行擴(kuò)增檢測(cè)，循環(huán)參數(shù)設(shè)定如表1(第一輪第1次和第2次)，PCR反應(yīng)完成后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，確定產(chǎn)物大小正確，使用AMPure XP磁珠純化回收PCR產(chǎn)物。然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板執(zhí)行第二輪PCR反應(yīng)，以獲得測(cè)序帶分子標(biāo)簽的文庫(kù)。反應(yīng)體系如下：DNA模板(10 ng/μl)2 μl、通用P7引物(含分子標(biāo)簽，10 μM)1 μl、通用P5引物(10 μM)1 μl和 2× PCR Ready Mix 15 μl (總體積30 μl)。配制好反應(yīng)體系后，執(zhí)行如下PCR程序如表1(第二輪)。最終PCR產(chǎn)物使用AMPure XP磁珠純化回收，使用HiSeqXTen測(cè)序儀(Illumina, San Diego，CA)進(jìn)行測(cè)序。設(shè)置軟件參數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，篩選、刪除、比對(duì)、分析等，得出目標(biāo)基因型結(jié)果，再通過(guò)軟件對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行基因注釋。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)檢測(cè)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；用χ2檢驗(yàn)先檢測(cè)等位基因和基因型在PLC組和對(duì)照組的頻率分布差異，用非條件Logistic回歸計(jì)算比值比(odds rati，OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)評(píng)價(jià)各等位基因、基因型與PLC發(fā)生的關(guān)系。利用Ensembl網(wǎng)站(http://asia.ensembl.org/)公布的5個(gè)地區(qū)人群(中國(guó)南方漢族、北京漢族、日本東京、尼日利亞和意大利亞托斯卡尼人群)基因多態(tài)性rs1882545位點(diǎn)基因型和基因分布頻率結(jié)果，采用χ2檢驗(yàn)分析廣西百色市及其周邊人群與這些人群該位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各步PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)定情況

2 結(jié)果

2.1 健康對(duì)照人群LAG-3 rs1882545等位基因分布及與其他國(guó)家(地區(qū))人群的比較 廣西百色市及其周邊健康對(duì)照人群LAG-3 rs1882545位點(diǎn)除1例未測(cè)出基因型，余299例DNA樣本均測(cè)出，以G等位基因?yàn)橹?，?0.57%，GG、GA、AA 3種基因型分布頻率分別為50.50%、40.13%、9.37%，符合Hardy-Weinberg平衡。LAG-3 rs1882545位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與中國(guó)南方漢族和尼日利亞人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與北京漢族、日本東京、意大利托斯卡尼比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 不同種族及地區(qū)人群LAG-3 rs1882545位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率的比較

2.2 PLC人群LAG-3 rs1882545等位基因分布與健康對(duì)照人群的比較 廣西百色市及其周邊PLC人群300例DNA樣本均測(cè)出LAG-3 rs1882545位點(diǎn)等位基因，GG、GA、AA 3種基因型分布頻率分別為45.00%、45.67%、9.33%，符合Hardy-Weinberg平衡。χ2檢驗(yàn)比較兩組基因型及等位基因rs1882545分布頻率，發(fā)現(xiàn)兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)非條件Logistic回歸分析，校正性別和年齡因素后結(jié)果顯示，rs1882545基因型和等位基因分布頻率與PLC的患病風(fēng)險(xiǎn)均無(wú)關(guān)(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 LAG-3 rs18825454與PLC患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

2.3 LAG-3 rs1882545與PLC易感性的分析 性別分層分析中男性及年齡分層(<55歲和≥55歲)PLC組和健康對(duì)照組LAG-3 rs1882545等位基因和基因型分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，經(jīng)非條件Logistic回歸分析，也與PLC的患病風(fēng)險(xiǎn)均無(wú)關(guān)(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4和表5。廣西百色市及其周邊地區(qū)女性PLC組和相應(yīng)健康對(duì)照組LAG-3 rs1882545基因型分布頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但女性PLC組A等位基因頻率明顯高于相應(yīng)健康對(duì)照組，經(jīng)χ2檢驗(yàn)計(jì)算(χ2=4.146，P=0.042)，提示女性攜帶A基因與患PLC有關(guān)；經(jīng)非條件Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)女性人群與患PLC的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)(P=0.042，OR=1.959，95%CI：1.017～3.771)，提示攜帶A等位基因患肝癌相對(duì)本次實(shí)驗(yàn)健康人群的風(fēng)險(xiǎn)增加，見(jiàn)表4。

表4 LAG-3 rs18825454與PLC患病風(fēng)險(xiǎn)的性別分層分析

表5 LAG-3 rs18825454與PLC患病風(fēng)險(xiǎn)的年齡分層分析

3 討論

本研究收集廣西百色市及其周邊PLC患者300例，對(duì)其進(jìn)行年齡和性別分層時(shí)發(fā)現(xiàn)<55歲年齡的人群為主，占比為63.67%，同時(shí)以男性患者居多(87.00%)，這與林子博等[7]學(xué)者報(bào)道的廣東順德地區(qū)PLC人群男性患者為主且年齡在22～55歲居多相一致。眾所周知慢性乙型病毒性肝炎(乙肝)是PLC發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]；劉慧妮[9]曾報(bào)道廣西百色市乙肝感染人群以男性居多，而且年齡以20～55歲占大比例，提示慢性乙肝可能是廣西百色市及其周邊人群PLC患者以男性居多且呈年輕化的原因。這與文獻(xiàn)報(bào)道我國(guó)肝癌患者男性遠(yuǎn)高于女性，年齡呈年輕化，已由原來(lái)的40～50歲提前至35～50歲的結(jié)果相一致[10]。

LAG-3也稱CD223，分子量為70 kDa，定位于人12號(hào)染色體 (12 p13.3)。作為免疫檢查點(diǎn)家族的一員，LAG-3是T細(xì)胞功能的抑制性分子，多種腫瘤微環(huán)境中有異常表達(dá)，參與腫瘤的免疫逃逸，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。有研究報(bào)道肝癌腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上LAG-3陽(yáng)性表達(dá)為65.00%，可能在肝癌發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[12]。已知SNP可使基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)量發(fā)生變化，在個(gè)體對(duì)某些藥物的反應(yīng)、對(duì)環(huán)境因素(如毒素)的敏感性、發(fā)展特定疾病的風(fēng)險(xiǎn)(特別是個(gè)體腫瘤遺傳易感性)等方面發(fā)揮重要的作用[13]。目前研究LAG-3基因多態(tài)性較少。已有研究報(bào)道LAG-3 rs19922452、rs951818和rs870849基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化的易感性相關(guān)，rs19922452 TT、rs951818 GG和rs870849 CT基因型使多發(fā)性硬化的風(fēng)險(xiǎn)降低[14]。劉愛(ài)娟[15]通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(PCR-RFLP)分析CD4基因rs2515733多態(tài)性位點(diǎn)基因頻率和LAG-3基因rs870849多態(tài)性位點(diǎn)基因頻率在特發(fā)性血小板減少性紫癜患者組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。這些研究表明LAG-3的不同位點(diǎn)在同一疾病、同一個(gè)位點(diǎn)與不同疾病的關(guān)聯(lián)性均具有差異性。

本研究收集廣西百色市及周邊健康對(duì)照者和PLC患者各300例，采用多重?cái)U(kuò)增及高通量測(cè)序測(cè)定LAG-3 rs1882545位點(diǎn)等位基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣西百色市及其周邊健康對(duì)照人群LAG-3 rs1882545位點(diǎn)，以G等位基因?yàn)橹?，?0.57%，GG、GA、AA 3種基因型分布頻率分別為50.50%、40.13%、9.37%，基因型和等位基因分布頻率與中國(guó)南方漢族和尼日利亞人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示本研究的基因分型方法具有一定的可信性。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)本文健康對(duì)照人群LAG-3 rs1882545基因型和等位基因分布頻率與北京漢族、日本東京、意大利托斯卡尼比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示LAG-3rs1882545基因多態(tài)性具有種族和地域差異。

本研究發(fā)現(xiàn)雖然在不分層或年齡分層或男性廣西百色市及周邊人群LAG-3 rs1882545等位基因和基因型分布頻率 PLC患者與健康對(duì)照患者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在女性人群中PLC患者A等位基因頻率(42.31%)明顯高于健康對(duì)照人群(27.27%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且攜帶A等位基因患PLC風(fēng)險(xiǎn)明顯增加(OR=1.959，95%CI：1.017～3.771)。由于納入本次研究的女性病例數(shù)較少，需要增加更多的女性病例數(shù)進(jìn)一步來(lái)確認(rèn)其相關(guān)性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在廣西百色市及其周邊人群中以男性年齡25～55歲為主，LAG-3 rs1882545基因型、等位基因分布頻率具有種族和地域差異，LAG-3 rs1882545 A等位基因可能與廣西百色市及其周邊女性人群PLC易感性有關(guān)，為廣西百色市及其周邊地區(qū)女性肝癌易感人群的篩選提供一定的理論依據(jù)。由于本次研究病例來(lái)源和病例數(shù)的局限性，需要后續(xù)增加病例數(shù)來(lái)進(jìn)一步深入研究。