(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低和骨組織結(jié)構(gòu)惡化為特征的疾病，導(dǎo)致骨折風(fēng)險易感性增加。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率隨著年齡的增長而增加，并且由于雌激素缺乏，絕經(jīng)后婦女中骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率最高，因為骨吸收和骨形成之間的平衡朝著骨吸收水平的增加轉(zhuǎn)移[1]。骨質(zhì)疏松癥影響著全世界大約2億人，其防治仍然是一項艱難的挑戰(zhàn)，需要我們?nèi)ミM一步研究和探索新的預(yù)防策略和更有效的治療方式[2]。骨質(zhì)疏松模型的建立是研究骨質(zhì)疏松發(fā)病機制，合理地選擇動物模型對實驗的結(jié)果起著至關(guān)重要的作用，是用藥干預(yù)治療防御的基礎(chǔ)[3]。卵巢摘除法由于操作簡單，造模易成功，實驗可重復(fù)性高，已成為骨質(zhì)疏松癥常用的動物造模方法，C57BL/6種屬的小鼠由于其遺傳信息明確，耐受性高，而且消耗的成本比大鼠少，造模周期短，因此選擇C57BL/6雌性小鼠作為實驗研究的基礎(chǔ)媒介[4]。本研究的目的是通過制備去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松模型，建立一種模擬人體病理的骨質(zhì)疏松癥。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 雌性C57BL/6小鼠，10～12周齡，體重20～25 g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[SCXK(湘)2019-0014]；冰凍切片機Leica CM1950(2019175001，德國)；SAKURA櫻花冷凍包埋盒(Surgipath FSC 22 Blue Frozen Section Compound Leica Biosystems Melbourne Pty Ltd-ABN)；Cryofilm type ⅡC(9)SECTION-LAB Co.Ltd.，Japan；TRAP/ALP染色試劑盒(294-67001，F(xiàn)UJIFILM WAKO)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105，碧云天)；熒光倒置顯微鏡(2015236500，Leica DMI3000B)，Micro CT掃描儀(QuantumGX2，PerkinElmer)。

1.2 實驗動物 本研究選取了10只雌性C57BL/6小鼠，10～12周齡，體重20～25 g。所有的動物實驗均完全遵守相關(guān)倫理審批要求，實驗動物飼養(yǎng)流程均嚴(yán)格遵守實驗室動物的飼養(yǎng)規(guī)程和使用指南。實驗前，所有購買的小鼠均于右江民族醫(yī)學(xué)院動物實驗中心檢疫室飼養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境，然后轉(zhuǎn)移至SPF級實驗室，每天觀察小鼠狀態(tài)。每個籠子飼養(yǎng)5只，不限水，標(biāo)準(zhǔn)飲食，室溫維持在24～26℃，濕度為55%～60%，光照時間適宜，實驗過程中小鼠也是繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF級實驗室。

1.3 實驗分組 10只雌性C57BL/6小鼠隨機分組，分別為卵巢摘除骨質(zhì)疏松模型(OVX)組和假手術(shù)(Sham)組，飼養(yǎng)環(huán)境和條件均保持一致。術(shù)后8周取10只小鼠的左邊股骨均進行Micro CT檢測，右邊股骨用包埋劑包埋，-80℃冰箱保存，由于骨組織較硬，未進行脫鈣，因此我們使用SECTION-LAB Co.Ltd切片裝置，將其黏附在骨組織包埋塊表面，使骨組織轉(zhuǎn)移至該切片裝置上，然后使用冰凍切片機進行冰凍切片，厚度為6 μm，行HE染色、TRAP染色、ALP染色、免疫熒光染色。

1.4 卵巢摘除術(shù) 將已分組的10只C57BL/6雌性小鼠，75%酒精消毒注射部位后，水合氯醛(4%，5 ml/kg，腹腔注射)進行麻醉，待其行動遲鈍后，背部備皮，消毒手術(shù)部位，從背部腎區(qū)附近雙側(cè)分別作一縱行切口，切開筋膜分離肌肉及腹膜，找到附著于脂肪組織上的粉紅色卵巢組織，完整摘除兩側(cè)卵巢組織，剩下Sham組5只小鼠，則切除卵巢旁小塊脂肪組織，手術(shù)針線層層縫合，慶大霉素消毒。術(shù)后3 d也連續(xù)用慶大霉素涂抹傷口，以防手術(shù)感染，摘除的卵巢塊經(jīng)冰凍切片(6 μm)，蘇木精伊紅(HE)染色法鏡下鑒定為卵巢組織。

1.5 外周血生物化學(xué)學(xué)檢測 麻醉小鼠后，眼球取血檢測血鈣(Ca)、磷(P)、鎂(Mg)、堿性磷酸酶(ALP)水平等，于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科檢驗，采用分光光度法檢測。

1.6 顯微斷層掃描技術(shù)(Micro CT) 分別取OVX組和Sham組小鼠的股骨標(biāo)本剔除干凈周邊軟組織，放置于4%多聚甲醛中浸泡24 h后進行Micro CT掃描，電壓90 kV；電流80 μA，掃描方式360°旋轉(zhuǎn)，成像視野9 mm×9 mm×9 mm，高分辨率模式分辨率18 μm，掃描時間14 min，掃描完畢后使用系統(tǒng)自帶的三維重建軟件對所掃描的圖片進行重建，得到三維Micro CT數(shù)據(jù)。

1.7 組織病理學(xué)檢查 自-80℃低溫冰箱取出OVX組和Sham組小鼠股骨頭的冰凍切片，將切片置于常溫10～15 min回溫至37℃，自然晾干，-20℃甲醇固定10 min，1×PBS緩沖液清洗，依次滴加蘇木素1 min，流水沖洗，伊紅染液覆蓋標(biāo)本30 s，70%、80%、90%、100%乙醇依次脫水，二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.8 組織化學(xué)染色 取OVX組和Sham組小鼠股骨頭冰凍切片行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)以及堿性磷酸酶染色(ALP染色)。將切片置于常溫10～15 min回溫37℃自然晾干，-20℃甲醇固定10 min，流水清洗，滴加適量的按比例配制的TRAP染色液覆蓋標(biāo)本，常溫放置30 min(酒石酸溶液∶酸性磷酸酶底物溶液A∶酸性磷酸酶底物溶液B為1∶9∶0.1配置混勻)，PBS清洗，二甲苯透明，中性樹膠封片。骨組織切片固定水洗后進行ALP染色，滴加0.1 mol AMPD-HCL緩沖液覆蓋組織標(biāo)本，10 min，滴加適量的堿性磷酸酶預(yù)混物溶液，室溫保濕盒孵育30 min，然后水洗，核染色試劑覆蓋組織5 s，水洗后二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.9 免疫熒光染色 取OVX組和Sham組小鼠股骨頭冰凍切片行免疫熒光染色。切片置于常溫10～15 min回溫37℃自然晾干，-20℃甲醇固定10 min。1xPBS緩沖液清洗2～3次，每次5 min，滴加PBS/1%BSA封閉液，保濕盒常溫放置40 min，4℃孵育一抗抗酒石酸酸性磷酸酶(以1∶1000的比例稀釋)過夜，DAPI(1 h)染色細(xì)胞核，免疫熒光倒置顯微鏡觀察組織。

2 結(jié)果

2.1 外周血生物化學(xué)檢測 行雙側(cè)卵巢切除術(shù)8周后，經(jīng)血清學(xué)檢測，OVX組與Sham組的鈣、磷、鎂含量變化不大，Sham組的ALP含量比OVX組的含量高(P<0.001)，見表1。

2.2 Micro CT檢查 小鼠在卵巢摘除術(shù)后8周，股骨經(jīng)Micro CT掃描三維重建后，與Sham組相比，無論是從橫斷面還是縱切面來看，OVX組的骨小梁數(shù)量減少，排列稀疏，間隔大，分離度也增加，見圖1。

表1 雙側(cè)卵巢切除術(shù)后8周小鼠生化指標(biāo)變化

注：A：Sham組(縱切面)；B：OVX組(縱切面)；C：Sham組(橫切面)；D：OVX組(橫切面)。

2.3 組織病理學(xué)檢查 小鼠術(shù)后8周，股骨組織HE染色結(jié)果顯示，Sham組骨小梁致密、完整、連續(xù)；OVX組骨小梁紊亂，出現(xiàn)斷裂(見圖2A、圖2B)。破骨細(xì)胞(細(xì)胞核>2)計數(shù)，單位面積內(nèi)Sham組的破骨細(xì)胞總數(shù)比OVX組的少(P<0.01)；在相同的視野下也發(fā)現(xiàn)OVX組破骨細(xì)胞的數(shù)目明顯多于Sham組(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2C、圖2D，表2。

注：A：Sham組；B：OVX組；C：Sham組；D：OVX組。

表2 術(shù)后8周骨組織切片破骨細(xì)胞計數(shù)

2.4 TRAP染色和ALP染色 小鼠骨組織TRAP染色，TRAP的活性部位呈紅紫色；ALP染色，ALP的活性部位呈藍(lán)色(茶褐色)。ALP和TRAP染色顯示，與Sham組相比，OVX組ALP酶分泌減少，但差異不明顯；而TRAP酶的分泌增多，紫紅色區(qū)域更深，分布面積更廣。

注：TRAP染色，A：Sham組，B：OVX組；ALP染色，C：Sham組，D：OVX組。

2.5 免疫熒光檢測結(jié)果 熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)OVX組的骨組織上TRAP蛋白(綠色熒光)的表達(dá)增多，見圖4。

注：A～C：Sham組；D～F：OVX組。

3 討論

隨著人口老齡化的增加，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。雌激素和孕激素可以影響骨的生長，雌激素的缺乏引發(fā)了骨質(zhì)流失的快速階段，增加絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女患骨質(zhì)疏松的風(fēng)險，影響骨代謝的平衡[5]，其水平降低，可顯著增加破骨細(xì)胞的活性，加速骨吸收，使骨形成不足[6]。在老化的骨骼中，雌激素減少會導(dǎo)致過量的破骨細(xì)胞(OC)介導(dǎo)的骨組織吸收，從而導(dǎo)致正常骨代謝失衡，在這一失衡過程中，由單核巨噬細(xì)胞分化而來的破骨細(xì)胞是唯一具有骨吸收生物學(xué)活性的細(xì)胞系[7]。因此，破骨細(xì)胞在生理和病理性的骨吸收中發(fā)揮核心作用，從而導(dǎo)致包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

本研究的實驗?zāi)康氖球炞C評定雙側(cè)卵巢切除后的C57BL/6小鼠是否形成骨質(zhì)疏松狀態(tài)，以便考究是否可以進行下一步的藥物治療骨質(zhì)疏松癥的活體實驗。由于大鼠的骨代謝周期久，造模時間長，用藥多，耗資大，因此我們選擇10～12周齡、成熟的、骨代謝水平趨于穩(wěn)定的C57BL/6雌性小鼠行雙側(cè)卵巢摘除法以建立骨質(zhì)疏松癥模型[8]?，F(xiàn)今也有很多其他的造模方法，如維甲酸、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)方法等。但是由于卵巢切除法簡單易行，成本小，不易感染，造模成功率高，如今成為了FDA和WHO公認(rèn)的研究絕經(jīng)后雌激素缺乏型骨質(zhì)疏松癥的最佳模型[9]。骨質(zhì)疏松模型的鑒定方法也多種多樣，從血清學(xué)骨代謝生化指標(biāo)、病理組織形態(tài)學(xué)分析、骨組織計量方法等均能闡述骨組織的改變情況。傳統(tǒng)的骨質(zhì)疏松模型鑒定方法單一，我們通過綜合多種檢測方法客觀評定骨質(zhì)疏松模型的成功與否，以便進行下一步的小鼠體內(nèi)藥物干預(yù)實驗。

既往的研究發(fā)現(xiàn)[10]，由于小鼠體積較小，使用雙能X線骨密度儀(dual energyX-ray absorptiometry，DEXA)測量小鼠的骨密度存在較大誤差，結(jié)果的準(zhǔn)確性不高；而Micro CT的分辨率可達(dá)微米級別，對骨組織的微結(jié)構(gòu)可進行精確的測量，其測量參數(shù)的一致性和可重復(fù)性更高[8]，更適合用于評估小鼠的骨微結(jié)構(gòu)的改變以及骨質(zhì)疏松模型，能更早、更真實地反映出老年骨組織結(jié)構(gòu)的改變情況[11]。本研究的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)小鼠股骨遠(yuǎn)端行Micro CT掃描重建后發(fā)現(xiàn)骨小梁的數(shù)目以及結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，而骨組織切片HE染色形態(tài)學(xué)觀察也證實了符合骨質(zhì)疏松的病理改變情況，初步驗證了骨質(zhì)疏松模型建立成功。

TRAP是顯示骨吸收以及破骨細(xì)胞活性的良好標(biāo)志物，可以比較直觀地反映出機體的骨代謝情況，觀察破骨細(xì)胞的分化程度；而ALP是反映成骨形成的重要標(biāo)志物。TRAP染色結(jié)果顯示TRAP酶的顏色以及分布面積增加，提示OVX組破骨細(xì)胞比Sham組的更加活躍；免疫熒光染色的結(jié)果也證實了這一結(jié)果；而ALP則相反，卵巢摘除后成骨細(xì)胞的活性及數(shù)目均降低。從血清生化指標(biāo)檢測以及病理組織切片HE、TRAP、ALP染色、免疫熒光結(jié)果分析均反映了骨形成活性降低，成骨細(xì)胞凋亡，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的動態(tài)失衡導(dǎo)致骨細(xì)胞功能的喪失，骨組織微結(jié)構(gòu)之間的空隙增加，骨質(zhì)疏松加劇，進一步證實了上述結(jié)果的可信。

骨小梁結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變，血清生化檢測指標(biāo)的變化以及病理組織染色反映了骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的改變，證實了雙側(cè)卵巢摘除法使小鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松模型很成功，可以進行后期小鼠體內(nèi)藥物的干預(yù)實驗，以期為骨質(zhì)疏松提供合理、有效的治療策略。