朱文龍，楊海松，張世泳，張萌萌，楊 清

microRNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA（non-coding RNA），由19 ～25 個(gè)核苷酸構(gòu)成，為單鏈RNA，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，參與較多生物學(xué)過程［1-6］。 miRNA-27a 被證實(shí)在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)，且與化療耐藥具有一定相關(guān)性［7-14］。 本研究旨在探究miRNA-27a 在人乳腺癌組織中的表達(dá)及其與乳腺癌多藥耐藥之間的關(guān)系， 為miRNA-27a 成為臨床上提高乳腺癌患者化療敏感性的分子標(biāo)志物提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2017 年6 月～2019 年1 月在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科治療擬行新輔助化療的乳腺癌患者100 例為實(shí)驗(yàn)組，行手術(shù)治療的乳腺纖維腺瘤患者40 例為對(duì)照組。 收集兩組研究對(duì)象的病灶組織，統(tǒng)計(jì)患者的發(fā)病年齡、月經(jīng)狀態(tài)、雌激素受體（ER）、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）等臨床病理特點(diǎn)。

乳腺癌患者入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）女性，具有新輔助化療指征；（2）化療前經(jīng)影像學(xué)、核醫(yī)學(xué)檢查無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，無同期發(fā)生的其他器官的惡性疾??；（3）入院前未接受任何相關(guān)治療，排除內(nèi)分泌治療、化療及放療對(duì)研究對(duì)象腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)狀態(tài)等的影響；（4）有可測(cè)量或可評(píng)價(jià)的腫瘤病灶、鉬鈀或B 超可測(cè)病變直徑≥2 cm；（5）化療前均在超聲引導(dǎo)下行穿刺活檢證實(shí)為乳腺癌，且病理類型均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；（6） 化療前穿刺活檢標(biāo)本行ER、孕激素受體、HER-2、Ki-67 免疫組織化學(xué)檢查；（7）無明顯化療禁忌。 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的Ⅳ期患者；（2）有化療禁忌，不能耐受化療的患者。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 化療方案統(tǒng)一采用以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的每?jī)芍蹺C 方案（表柔比星100 mg/m2，第1天；環(huán)磷酰胺600 mg/m2，第1 天），序貫紫杉類每周P 方案（80 mg/m2）化療。 完成新輔助治療后12 ～21 d 接受手術(shù)治療，所有患者治療前均簽署相關(guān)治療知情同意書。

1.2.2 療效評(píng)價(jià) 根據(jù)實(shí)體瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（the response evaluation criteria in solid tumors，RECIST，1.1 版），完全緩解（CR）和部分緩解（PR）為有效，疾病穩(wěn)定（SD）和疾病進(jìn)展（PD）為耐藥。對(duì)手術(shù)標(biāo)本應(yīng)用病理組織學(xué)評(píng)價(jià)新輔助化療療效，病理性完全緩解（pCR）以手術(shù)標(biāo)本連續(xù)切片原發(fā)腫瘤區(qū)域無浸潤(rùn)癌組織、區(qū)域淋巴結(jié)無癌殘留為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 測(cè)定mi-R27a 的表達(dá) 用Trizol RNA 試劑盒提取乳腺癌及乳腺纖維腺瘤手術(shù)標(biāo)本中總RNA，操作按照說明書進(jìn)行，測(cè)量總RNA 濃度，取1 μg RNA 按反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明合成cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)miR-27a 的表達(dá)情況。GAPDH 為內(nèi)參，正向引物為：CGGAGTCAACGGAT TTGGTCGTAT，反向引物為：AGCCTTCTCCATGGT GGTGAAGAC；miR-27a 正向引物為：TAATCGTGT TCACAGTGGCTAAG；反向引物為：AAAGGTTGAT CTCGTCTCTCA。 反應(yīng)條件：95 ℃3min，（95 ℃12s，62 ℃60 s）× 40 cycles。 反應(yīng)結(jié)后確認(rèn)Real-time PCR 的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR 定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 基因的表達(dá)量F=2-△△Ct，3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-△△Ct的方法進(jìn)行分析。

1.3.1 主要試劑 Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen有限公司； 組織裂解液、miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR 試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；無水乙醇、異丙醇、氯仿購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；內(nèi)參GAPDH 引物，miR-27a 引物購(gòu)自昆明鼎國(guó)生物。

1.3.2 主要儀器 雙人單面超凈工作臺(tái)，微量可調(diào)加樣器，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，渦旋混勻器，TG-16W 臺(tái)式高速離心機(jī)，電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)移槽，紫外分光光度儀NanoDrop1000，Real-Time 實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)繪圖軟件GraphPad Prism 7 繪制統(tǒng)計(jì)圖。分析結(jié)果用（x±s）表示，比較方法采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效 新輔助化療后，達(dá)到完全緩解患者共17 例，部分緩解患者共61 例，疾病穩(wěn)定患者共22 例，疾病進(jìn)展患者共0 例，其中達(dá)到pCR 患者共26 例。 評(píng)估為化療有效患者共78 例， 有效率為78%，pCR 率為26%。

2.2 miR-27a 在乳腺癌和乳腺纖維腺瘤中的表達(dá)Real-time PCR 方法檢測(cè)乳腺癌組和乳腺纖維腺瘤組中miR-27a 的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-27a 在乳腺纖維腺瘤組中高表達(dá)，與乳腺癌組相比，表達(dá)增高（2.1 ± 0.30）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。再進(jìn)一步分析乳腺癌亞組，結(jié)果顯示miR-27a 在化療有效組中高表達(dá)，與無效組相比，表達(dá)增高（2.8 ±0.30）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖1 乳腺纖維腺瘤組和乳腺癌組miR-27a 相對(duì)表達(dá)量

2.3 miR-27a 在乳腺癌患者中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 分析miR-27a 的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-27a 低表達(dá)患者的雌激素受體和孕激素受體陽(yáng)性率高于miR-27a 高表達(dá)患者（P＜0.05）。 相較于miR-27a 的低表達(dá)的乳腺癌患者，高表達(dá)miR-27a 的患者有較高的pCR 率（P＜0.05）。 相較于miR-27a 的低表達(dá)的乳腺癌患者， 高表達(dá)miR-27a 的患者有著更好的化療療效（P＜0.05）。 而與其他臨床病理特征無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表1。

圖2 乳腺癌化療有效組和乳腺癌化療無效組miR-27a相對(duì)表達(dá)量

表1 miR-27a 在乳腺癌患者中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

研究證實(shí)，miRNA-27a 參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程［15-16］。 miRNA-27 存在于19 號(hào)染色體上，miRNA-27a 能夠負(fù)向調(diào)控基因的表達(dá)， 通過與靶3'UTR 區(qū)（3-untranslated region）特異性結(jié)合發(fā)揮作用［17］。研究表明，miRNA-27a 可促進(jìn)腫瘤發(fā)展、誘導(dǎo)原始粒細(xì)胞分化等過程， 已被證實(shí)高表達(dá)于乳腺癌、宮頸癌及胃癌等癌組織中，與化療、放療及內(nèi)分泌耐藥等密切相關(guān)［18-19］。

既往有少量研究表明，miRNA-27a 高表達(dá)于乳腺癌組織中，miRNA-27a 表達(dá)越高的患者臨床分期越晚，而在晚期乳腺癌中miRNA-27a 表達(dá)則更高［20-21］。 提示miRNA-27a 為促癌miRNA。 然而，本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-27a 在乳腺纖維腺瘤中的表達(dá)明顯高于乳腺癌組織中的表達(dá)。這提示miRNA-27a可能在乳腺癌中起到抑癌作用。 可見miRNA-27a在乳腺癌組織中的表達(dá)情況尚無統(tǒng)一結(jié)論，需更多的研究來探索明確。

有研究者發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中，miRNA-27a 可通過抑制FZD7/β-catenin 通路來下調(diào)MDR1/P-gp 的表達(dá)， 從而逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥［22］。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-27a 通過降低MDR1/P-gp 的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞株對(duì)化療的耐藥性，該細(xì)胞株存在多柔比星的耐藥性［23］。 miR-27a 通過降低MDR1/P-gp 的表達(dá)能夠提高胃癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性［24］。 相似的結(jié)論在卵巢癌的研究中證實(shí)，miR-27a 調(diào)控MDR1/P-gp 的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性［25］。 本研究分析miRNA-27a的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miRNA-27a 的患者，新輔助化療后有較高的pCR 率；且與乳腺癌耐藥組相比，化療有效組中的miRNA-27a 的表達(dá)明顯升高。 這可能與miRNA-27a 在乳腺癌中的高表達(dá)可能逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)藥物耐藥有關(guān)。

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病， 研究相較于其它非三陰性乳腺癌，三陰性乳腺癌中miRNA-27a的表達(dá)較高［26-27］。 本研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體、孕激素受體陰性的患者中miR-27a 的表達(dá)高于雌激素受體、孕激素受體陽(yáng)性的患者，表明miRNA-27a 可能與乳腺癌的分子分型密切相關(guān)，并且可能參與調(diào)控內(nèi)分泌治療療效。

本研究提示乳腺癌中miRNA-27a 高表達(dá)者有較高的pCR 率，其表達(dá)能夠作為預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的指標(biāo)。 miR-27a 低表達(dá)患者的雌激素受體、 孕激素受體陽(yáng)性率高于miR-27a 高表達(dá)患者，其表達(dá)可能與內(nèi)分泌治療療效相關(guān)。 本研究樣本量較小， 后續(xù)會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-27a 在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)行密切隨訪分析miRNA-27a 與預(yù)后的相關(guān)性。 而miRNA-27a 的下游靶基因及其相關(guān)的分子機(jī)制，還需體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)深入研究其相關(guān)分子機(jī)制，miRNA-27a 可能成為乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后判斷的新靶點(diǎn)。