張 雷,朱稀雯,何 堃,龔建平,彭自力△

(1.重慶市奉節(jié)縣人民醫(yī)院肝膽外科 404600；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科 400010)

含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)是由NLRP3、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(ASC)和pro-半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)組成的蛋白復(fù)合體，是NLR家族中目前研究最明確的成員。它能被多種分子、細(xì)菌或病毒激活，促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-18、IL-1β等炎性因子的成熟與分泌，與痛風(fēng)、2型糖尿病、阿爾茨海默病、非酒精性脂肪肝等炎性疾病有關(guān)[1]。

自噬對機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)必不可少，其參與了機(jī)體免疫應(yīng)答并對炎性反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。有研究證實(shí)，在棕櫚酸(PA)導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡中，自噬可對細(xì)胞起保護(hù)作用[2]。還有報道稱自噬可以通過降解NLRP3炎癥小體抑制IL-1β的產(chǎn)生[3]。P62是自噬最主要的結(jié)合蛋白,它含有TRAF6結(jié)合域(TB)，LC3互相作用區(qū)域(LIR)及泛素結(jié)合區(qū)域(UBA)。因此，其可以和多聚泛素化鏈結(jié)合，識別泛素化底物并運(yùn)至自噬體[4]。

在非酒精性脂肪肝中P62是否可以介導(dǎo)并識別ASC的泛素化，從而促進(jìn)NLRP3炎癥小體降解還有待證實(shí)。因此，本實(shí)驗(yàn)將檢測PA刺激Kupffer細(xì)胞(KCs)后，P62與ASC的互相作用及泛素化水平，探討自噬體對炎癥小體蛋白的調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

NLRP3、ASC和β-actin抗體(武漢三鷹公司產(chǎn)品)，LC3抗體(美國Cell Signaling公司產(chǎn)品)，P62/SQSTM1、Beclin-1抗體(美國Abcam公司產(chǎn)品)，Anti-Ubiquitin抗體(美國Millipore公司產(chǎn)品)。蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。IL-1β ELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠肝臟KCs的分離及處理

小鼠異氟烷吸入麻醉，消毒后逐層開腹，顯露肝臟及門靜脈，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)5 mL由門靜脈灌注肝臟至黃褐色。小心取下肝臟轉(zhuǎn)入0.15%Ⅳ型膠原酶中，碎肝、過濾后進(jìn)行梯度離心和選擇性貼壁培養(yǎng)，得到純化KCs[5]。KCs培養(yǎng)48 h后分為對照組、PA組、渥曼青霉素組、雷帕霉素組。對照組：常規(guī)培養(yǎng)基；PA組：檢測時間點(diǎn)前12 h向培養(yǎng)基中加入PA，終濃度為0.5 mmol/L；渥曼青霉素組：50 μmol/L 渥曼青霉素預(yù)處理4 h，更換培養(yǎng)基后，再用0.5 mmol/L PA刺激12 h；雷帕霉素組：50 μmol/L雷帕霉素預(yù)處理4 h，更換培養(yǎng)基后，再用0.5 mmol/L PA刺激12 h。

1.2.2Western blot檢測

按照總蛋白提取試劑盒說明書的方法提取各處理組小鼠KCs總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組KCs總蛋白濃度并計算上樣量。煮沸變性后按30 μg總蛋白上樣。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5% 脫脂牛奶室溫下封閉PVDF膜1 h。TBST洗滌3次，每次5 min，再置于4 ℃下，一抗(抗LC3、NLRP3、ASC、caspase-1、Beclin-1)孵育過夜。PVDF膜在室溫下漂洗3次，置于稀釋之后的二抗中，室溫孵育2 h。取出PVDF膜輕輕漂洗后放入干凈培養(yǎng)皿，將1∶1配制的電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液均勻涂抹于PVDF膜上，在Bio-Rad曝光儀中曝光、采圖。

1.2.3IL-1β測定

用ELISA檢測KCs上清液中IL-1β表達(dá)水平，按試劑盒說明操作。

1.2.4激光共聚焦檢測P62和ASC及P62和LC3的共表達(dá)

將提取自小鼠的KCs接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，給予相應(yīng)處理因素。棄去培養(yǎng)基，用PBS洗干凈后加入10%甲醛室溫固定30 min。0.2%Trion-100打孔，37 ℃ 5 min，PBS洗滌3次。山羊血清滴于細(xì)胞上，37 ℃孵箱封閉1 h。滴加按比例稀釋的一抗(ASC和P62)，4 ℃冰箱過夜。棄去一抗，PBS漂洗3次后加入相應(yīng)二抗，37 ℃暗盒中孵育2 h。PBS漂洗后，滴加DAPI染液，37 ℃暗盒中孵育5 min。漂洗晾干后滴加防猝滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡采圖。

1.2.5免疫共沉淀檢測KCs中ASC與P62結(jié)合情況

細(xì)胞用冰PBS洗滌后，加入RIPA裂解液，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。保留上清液，用BCA試劑盒檢測每組蛋白水平并標(biāo)化。將標(biāo)化的蛋白裂解液加入裝有磁珠的EP管中，4 ℃摩天輪旋轉(zhuǎn)混勻孵育1 h，去除已經(jīng)存在的抗原抗體復(fù)合物。每組上清液分為兩管，分別加入抗ASC一抗和IgG抗體，均于摩天輪上4 ℃孵育過夜。然后將孵育過夜的蛋白裂解液轉(zhuǎn)移至裝有磁珠的EP管中，4 ℃摩天輪孵育2 h。將上述EP管置于磁力架上，吸去上清液，剩余即為磁珠-抗原抗體復(fù)合物。PBST和dilute buffer洗滌后，加入loading buffer開水煮沸8～10 min，再置于磁力架上，將上清液轉(zhuǎn)入新EP管中，即為所需抗原抗體復(fù)合物。下步分析同Western blot檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組KCs中LC3、Beclin-1及NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的相對表達(dá)水平

與對照組比較，PA組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化明顯增加，且NLRP3、ASC、Beclin-1和caspase-1蛋白的表達(dá)水平也明顯升高(P<0.05)。渥曼青霉素組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ較PA組低，且NLRP3、ASC、capase-1表達(dá)水平增加(P<0.05)。雷帕霉素組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ較PA組增加，NLRP3、ASC和caspase-1表達(dá)水平較PA組下降(P<0.05)，見圖1。

a:P<0.05。

2.2 各組KCs上清液IL-1β的表達(dá)水平

與對照組比較，PA組IL-1β水平明顯升高(P<0.05)。渥曼青霉素組IL-1β水平較PA組進(jìn)一步升高(P<0.05)；而雷帕霉素組IL-1β水平較PA組明顯降低(P<0.05)，見圖2。

a:P<0.05。

2.3 P62與ASC共定位表達(dá)

綠色熒光抗體標(biāo)記ASC；紅色熒光抗體標(biāo)記P62，激光共聚焦顯微鏡觀察各組KCs中P62、ASC的表達(dá)。PA組P62和ASC表達(dá)水平均較對照組均明顯增加。P62與ASC存在共定位表達(dá)，且PA組共定位關(guān)系增強(qiáng)，見圖3。

標(biāo)尺：10 μm。

2.4 LC3與P62共定位表達(dá)

綠色熒光抗體標(biāo)記LC3；紅色熒光抗體標(biāo)記P62，激光共聚焦顯微鏡觀察各組KCs中P62和LC3的表達(dá)。PA組P62和LC3表達(dá)水平均較對照組均明顯增加。P62與LC3存在共定位表達(dá)，且PA組共定位關(guān)系增強(qiáng)，見圖4。

標(biāo)尺：10 μm。

2.5 免疫共沉淀檢測小鼠KCs中LC3、P62和ASC的結(jié)合情況

PA刺激的KCs中ASC表達(dá)較對照組明顯增多，同時，與ASC結(jié)合的蛋白復(fù)合體中LC3和P62表達(dá)水平也明顯增多，見圖5。

圖5 免疫共沉淀檢測小鼠KCs中LC3、P62和ASC的結(jié)合情況

2.6 PA刺激前后ASC蛋白復(fù)合物總泛素化水平的變化

由于ASC-P62-LC3具有相互作用，P62具有識別泛素化蛋白的能力，因此進(jìn)一步研究ASC的泛素化水平。Western blot 檢測ASC泛素化水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA能明顯誘導(dǎo)ASC總蛋白增加，同時泛素化ASC也明顯升高，見圖6。

圖6 PA刺激前后ASC蛋白復(fù)合物總泛素化水平的變化

3 討 論

近年來，自噬和NLRP3炎癥小體間的相互作用受到廣泛關(guān)注。實(shí)驗(yàn)中，激光共聚焦顯微鏡證實(shí)KCs中ASC與P62、LC3存在共定位，且在PA刺激后，ASC與P62、LC3的共定位顆粒數(shù)增加，提示P62在自噬和NLRP3炎癥小體的鏈接中起重要作用。免疫共沉淀的結(jié)果顯示ASC與LC3、P62確有互相作用，且在PA刺激下其形成的蛋白復(fù)合體數(shù)量增多，這進(jìn)一步證實(shí)P62介導(dǎo)ASC與LC3的連接。

P62是一種由應(yīng)激產(chǎn)生的蛋白，參與多種信號通路，且在細(xì)胞增殖、分化中發(fā)揮作用[6]。同時，它也是維持線粒體形態(tài)和功能的關(guān)鍵分子，參與糖尿病、肥胖、腫瘤等多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程[7]。P62還是雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的組成部分，其對S6K1磷酸化，是調(diào)節(jié)氨基酸激活的mTOR信號所必需的[8]。作為一種泛素結(jié)合蛋白，P62是自噬體最重要的結(jié)合蛋白。在自噬過程中，P62識別并結(jié)合泛素化蛋白，與LC3Ⅱ形成復(fù)合體，再將受損細(xì)胞器、錯誤折疊蛋白等在自噬溶酶體內(nèi)被降解。當(dāng)細(xì)胞自噬受到抑制后，常發(fā)生P62的蓄積。因此，P62被認(rèn)為是反映細(xì)胞自噬活性的標(biāo)志物之一[9]。

在細(xì)胞質(zhì)中，P62能通過PB結(jié)構(gòu)域，形成P62-泛素化結(jié)合蛋白聚合體，為進(jìn)一步在自噬溶酶體中降解發(fā)揮作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)在PA刺激KCs的過程中，增強(qiáng)自噬能減少NLRP3炎癥小體蛋白。LC3泛素化修飾系統(tǒng)在自噬小體形成和成熟的過程中非常重要[11]。進(jìn)一步探討泛素化修飾在NLRP3炎癥小體降解中的作用發(fā)現(xiàn)，PA刺激下P62、LC3與ASC形成復(fù)合物增多；同時，檢測ASC的泛素化水平發(fā)現(xiàn)，ASC的泛素化水平在PA刺激后也明顯增加。因此，推測自噬體能降解NLRP3炎癥小體水平，這一過程是通過P62識別和結(jié)合炎癥小體中泛素化的ASC分子而實(shí)現(xiàn)的。

近年來，有研究表明蛋白的兩種降解機(jī)制——泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬是存在聯(lián)系的，而不是完全獨(dú)立的系統(tǒng)。當(dāng)?shù)鞍酌阁w系統(tǒng)受抑制，自噬水平將增高，表明這兩個系統(tǒng)可能是相互支持的[12]。作為重要的選擇性自噬結(jié)合蛋白，P62通過UBA、LIR及PB1結(jié)構(gòu)域?qū)⒎核鼗鞍姿腿胱允扇苊阁w中降解；同時P62也可將泛素化蛋白送入蛋白酶體降解，將蛋白降解的兩種機(jī)制聯(lián)系起來[13-14]。P62的TB結(jié)構(gòu)域可與TRAF6結(jié)合，TRAF6是一種經(jīng)典多功能的E3連接酶，而P62-TRAF6還可通過調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運(yùn)參與細(xì)胞信號的調(diào)節(jié)[15-16]。在P62-ASC介導(dǎo)的自噬對NLRP3炎癥小體的降解中TRAF6是否扮演角色還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，在PA刺激KCs后，自噬體與NLRP3炎癥小體的表達(dá)增加且互相作用增強(qiáng)，P62也同步升高，P62-ASC泛素化促進(jìn)P62將NLRP3炎癥小體轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬體，在自噬調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體降解的機(jī)制中有重要作用。