劉栩晗，李國生,李欣宇，高政南，黃 瀾，劉亞莉

(1. 遼寧省大連市中心醫(yī)院,遼寧 大連 116033；2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧 大連 116011)

內(nèi)臟白色脂肪組織的過度沉積及相關(guān)功能異常是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生的關(guān)鍵因素[1]。胰島素敏感組織異位脂沉積造成的脂誘性胰島素抵抗是肥胖2型糖尿病發(fā)病的重要推動(dòng)因素[2]。既往研究表明,小檗堿可通過過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPARs)信號通路誘導(dǎo)內(nèi)臟白色脂肪組織解耦聯(lián)蛋白(UCP1)表達(dá)增加， UCP1增加可耗能散熱，增強(qiáng)脂肪細(xì)胞脂的原位清除和降血脂的能力[3-6], 但是驅(qū)動(dòng)這個(gè)過程的信號通路仍不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究小檗堿對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)信號及白/棕脂肪組織表型特征及特異性基因表達(dá)改變的影響,探討其作為棕色脂肪的誘導(dǎo)劑改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只7周齡SPF級健康金黃地鼠，雌雄各半,體質(zhì)量110.3～133.9 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006，普通飼料喂養(yǎng)，血糖(4.16±0.85) mmol/L。

1.2試劑及儀器 日立7600全自動(dòng)生化分析儀。胰島素、瘦素、脂聯(lián)素ELISA試劑盒購自江蘇酶免生物科技有限公司。游離脂肪酸檢測試劑盒購自英國Randox公司。德國Qiagen公司RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Bio-rad公司熒光定量試劑盒和熒光定量PCR儀CFX96 Touch，TaKaRa公司HotStarTaqTMDNA聚合酶，美國Promea公司Oligo-dT和RNase inhibitor；美國Sigma公司小檗堿及鏈脲菌素(STZ)。美國強(qiáng)生公司穩(wěn)豪One-Touch血糖儀。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 按照文獻(xiàn)[7]建立肥胖胰島素抵抗和肥胖2型糖尿病地鼠模型。從60只健康地鼠中隨機(jī)取10只作為對照組，給予普食飼養(yǎng)；余50只給予高脂飲食飼養(yǎng)。飼養(yǎng)4周后，從50只高脂飲食飼養(yǎng)的地鼠中隨機(jī)取10只腹腔注射40 mg/kg的檸檬酸緩沖液作為胰島素抵抗組，余40只腹腔注射40 mg/kg(無菌檸檬酸緩沖液配制1% STZ 溶液) STZ進(jìn)行2型糖尿病造模，各組地鼠繼續(xù)按腹腔注射前的飲食喂養(yǎng)2周。經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)確定29只地鼠2型糖尿病造模成功，從中隨機(jī)選擇10只作為2型糖尿病組，10只作為2型糖尿病小檗堿組。2型糖尿病小檗堿組給予小檗堿150 mg/kg溶于PBS/羧甲基纖維素溶液中灌服，其余3組均灌服同等體積的PBS/羧甲基纖維素溶液，均1次/d，連續(xù)9周。實(shí)驗(yàn)最后1 d，各組地鼠禁食12 h、禁食9.5 h后稱體質(zhì)量給藥，給藥后2.5 h處死并留血液標(biāo)本，迅速分離雙側(cè)腎周圍脂肪墊、腸系膜脂肪組織、子宮旁或附睪旁脂肪組織并稱質(zhì)量，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4觀察指標(biāo)與方法

1.4.1口服葡萄糖耐量試驗(yàn)及胰島素釋放試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物前按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)及胰島素釋放試驗(yàn)。

1.4.2生化指標(biāo)檢測 采用穩(wěn)豪血糖儀檢測空腹血糖，日立全自動(dòng)生化分析儀7600檢測血脂[三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和總膽固醇(TC)]水平。按照ELISA試劑盒說明檢測血瘦素、胰島素、脂聯(lián)素、游離脂肪酸水平。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感指數(shù)。

1.4.3內(nèi)臟脂肪質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪占比 記錄各組地鼠雙側(cè)腎周圍脂肪墊、腸系膜脂肪組織、子宮旁或附睪旁脂肪組織的總重量，計(jì)算內(nèi)臟脂肪占比(內(nèi)臟脂肪質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。

1.4.4內(nèi)臟脂肪組織中TGF-β1信號通路、白/棕脂肪組織轉(zhuǎn)換通路及其靶基因mRNA表達(dá)檢測取各組地鼠脂肪組織30 mg，提取總RNA，檢測RNA濃度及純度。根據(jù)iQ SYBR Green Mix Kit操作說明書進(jìn)行目標(biāo)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。PCR檢測條件：95 ℃ 3 min, 95 ℃ 10 s 60 ℃ 45 s 45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，應(yīng)用反應(yīng)產(chǎn)物的溶解曲線檢測其均一性，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。設(shè)立陰性對照，內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白(β-actin)。擴(kuò)增前，每對引物的擴(kuò)增效率經(jīng)檢測均接近于1。使用 2[-Delta Delta C (T)]方法計(jì)算樣本目標(biāo)基因的相對含量[8]。TGF-β1、TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ、母親DPPT同源物2(Smad2)、Smad3、Smad4、Smad7、Smad泛素化作用相關(guān)因子2(Smurf2)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰輔酶A去飽和酶-1(SCD-1)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、PR結(jié)構(gòu)域蛋白16(PRDM16)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)、過氧化物酶體增殖活化受體γ(PPARγ)、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活者1α(PGC1α)、解耦聯(lián)蛋白1(UCP1)、極長鏈脂肪酸延長因子3(Elovl3)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(Cebpα)、細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的DFFA樣效應(yīng)因子a (Cidea)和β肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物序列見表1。各指標(biāo)結(jié)果以相對定量2-ΔΔCt法表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組地鼠代謝表型和代謝特征比較 與對照組比較，2型糖尿病組和胰島素抵抗組地鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪占比、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、游離脂肪酸、瘦素、胰島素抵抗指數(shù)和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)的血糖水平、葡萄糖曲線下面積均明顯增高(P均<0.05)，HDL-C、脂聯(lián)素、胰島素敏感指數(shù)均明顯降低(P均<0.05)；胰島素釋放試驗(yàn)中，胰島素抵抗組地鼠各時(shí)間點(diǎn)的血漿胰島素水平和胰島素曲線下面積均明顯增高(P均<0.05)，2型糖尿病組30 min、60 min時(shí)血漿胰島素水平均明顯降低(P均<0.05)，120 min、180 min時(shí)血漿胰島素水平均明顯升高(P均<0.05)。與2型糖尿病組比較，2型糖尿病小檗堿組地鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪占比、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、游離脂肪酸、瘦素、胰島素抵抗指數(shù)和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)的血糖水平、葡萄糖曲線下面積均明顯降低(P均<0.05)，HDL-C、脂聯(lián)素、胰島素敏感指數(shù)均明顯升高(P均<0.05)；胰島素釋放試驗(yàn)中， 30 min、60 min時(shí)血漿胰島素水平均明顯升高(P均<0.05)，120 min、180 min時(shí)血漿胰島素水平均明顯降低(P均<0.05)。見表2、表3及表4。

表1 內(nèi)臟脂肪組織中TGF-β1信號通路、白/棕脂肪組織轉(zhuǎn)換通路及其靶基因熒光定量PCR檢測引物

表2 各組地鼠的代謝表型特征指標(biāo)比較

表3 各組地鼠口服葡萄糖耐量試驗(yàn)血糖比較

表4 各組地鼠胰島素釋放試驗(yàn)指標(biāo)比較

2.2各組地鼠內(nèi)臟脂肪組織中TGF-β1通路、白/棕脂肪組織轉(zhuǎn)換通路基因的mRNA表達(dá)情況 與對照組比較，2型糖尿病組和胰島素抵抗組地鼠內(nèi)臟脂肪組織中TGF-β1、TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4和白色脂肪組織特異基因FAS、ACC、SCD-1 表達(dá)明顯增加(P均<0.05)，且2型糖尿病組均明顯高于胰島素抵抗組(P均<0.05)；PRDM16、C/EBPβ、PGC1α、PPARγ、Smad7、Smurf2及棕色脂肪組織特異基因UCP1、Elovl3、Cebpα、Cidea表達(dá)均明顯減少(P均<0.05)，且2型糖尿病組均明顯少于胰島素抵抗組(P均<0.05)。與2型糖尿病組和胰島素抵抗組比較，2型糖尿病小檗堿組地鼠內(nèi)臟脂肪組織中TGF-β1、TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4、FAS、ACC、SCD-1表達(dá)明顯減少(P均<0.05)，PRDM16、C/EBPβ、PGC1α、PPARγ、Smad7、Smurf2及UCP1、Elovl3、Cebpα、Cidea表達(dá)明顯增加(P均<0.05)。 見表5。

表5 各組2型糖尿病地鼠內(nèi)臟脂肪組織中TGF-β1通路、白/棕脂組織轉(zhuǎn)換通路基因的mRNA表達(dá)情況

3 討 論

目前極具吸引力的靶向治療肥胖和2型糖尿病及相關(guān)疾病的新策略和新途徑是促使白色脂肪棕色化[9]。最近的研究表明,小檗堿治療糖尿病的機(jī)制可能與其激活棕色脂肪促進(jìn)白/棕色脂肪組織轉(zhuǎn)化有關(guān)，但是驅(qū)動(dòng)這個(gè)作用的分子機(jī)制尚未完全清楚[10-12]。

TGF-β1受體(TβR)主要包括TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ 3個(gè)亞型。活化的TGF-β1首先與TβRⅡ結(jié)合或被TβR Ⅲ 傳遞給TβRⅡ，改變成易被TβR I識別的構(gòu)像而形成TβRⅡ-TGF-β1-TβR I復(fù)合物。Smads蛋白是TGF-β1信號通路中細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中介分子。活化的TβR I特異地識別磷酸化受體調(diào)節(jié)型Smad2/Smad3。磷酸化的Smad2/Smad3與Smad4共配體形成復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)控靶基因。棕色脂肪細(xì)胞表達(dá)的關(guān)鍵基因PRDM16和PGC1α是Smad3的靶向調(diào)節(jié)基因。Smad3可直接結(jié)合PGC1α的啟動(dòng)子而抑制其表達(dá)[13]。而抑制型Smad7可與Smad2/Smad3競爭性結(jié)合TβR I，阻斷Smad2/Smad3與受體的相互作用，或招募并增強(qiáng)Smurf2等介導(dǎo)的泛素連接酶降解TβR I和Smad2/Smad3蛋白，而減弱TGF-β1信號，從而對Smad介導(dǎo)的經(jīng)典信號傳導(dǎo)起反饋抑制調(diào)節(jié)的作用[14]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，2型糖尿病組和胰島素抵抗組地鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪占比、血糖、TC、TG、LDL-C、游離脂肪酸、瘦素、胰島素抵抗指數(shù)和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)的血糖水平、葡萄糖曲線下面積均明顯增高，HDL-C、脂聯(lián)素、胰島素敏感指數(shù)均明顯降低；內(nèi)臟脂肪組織中TGF-β1、TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4和白色脂肪組織特異基因FAS、ACC、SCD-1 表達(dá)明顯增加，而PRDM16、C/EBPβ、PGC1α、PPARγ、Smad7、Smurf2及棕色脂肪組織特異基因UCP1、Elovl3、Cebpα、Cidea表達(dá)明顯減少。這顯示在模型地鼠內(nèi)臟脂肪組織中，TGF-β1信號通路活性增強(qiáng)，Smad3表達(dá)增加可抑制棕色脂肪細(xì)胞關(guān)鍵基因PRDM16和PGC1α的表達(dá)，而白色脂肪關(guān)鍵基因FAS、ACC和SCD-1的表達(dá)增加可抑制產(chǎn)熱耗能并增強(qiáng)儲(chǔ)脂，導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪組織脂沉積進(jìn)一步增加。同時(shí)，增加的脂沉積可失活CPT1，造成脂肪酸β-氧化異常[15]。這將增加內(nèi)臟脂肪組織脂沉積并形成惡性循環(huán)，有助于形成脂誘性胰島素抵抗，內(nèi)臟脂肪組織脂含量超載，并促進(jìn)肥胖性2型糖尿病的發(fā)生。而小檗堿干預(yù)后，上述各指標(biāo)均明顯改善，提示小檗堿可能通過抑制TGF-β1信號通路，從而誘導(dǎo)內(nèi)臟白色脂肪棕色化基因表型轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)產(chǎn)熱耗能效應(yīng)，減輕內(nèi)臟脂肪組織脂沉積，從而改善脂誘性胰島素抵抗。

綜上所述， TGF-β1信號通路表達(dá)增強(qiáng)可促進(jìn)白色脂肪組織成脂基因表達(dá)而導(dǎo)致2型糖尿病脂誘性胰島素抵抗的形成和進(jìn)展。小檗堿治療可抑制TGF-β1信號通路，誘導(dǎo)棕色脂肪細(xì)胞特異性基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)內(nèi)臟白色脂肪組織獲得棕色脂肪表型，有助于改善脂誘性胰島素抵抗及內(nèi)臟脂肪組織功能。因此，TGF-β1信號通路及白/棕脂肪組織轉(zhuǎn)換通路有望成為小檗堿治療2型糖尿病的分子靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。