楊金龍 張榮明 魏巍 湯鋒 陳健

1錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院燒傷整形小兒外科（遼寧錦州121000）；2遼寧省錦州市中心醫(yī)院整形外科（遼寧錦州121000）；3中國人民解放軍第968 醫(yī)院燒傷整形科（遼寧錦州121000）

糖尿病皮膚潰瘍是常見的糖尿病并發(fā)癥之一， 近些年干細胞移植用于該病的治療價值受到越來越多關注。但是，高糖環(huán)境對干細胞的增殖、遷移及分化具有抑制作用，不利于干細胞向糖尿病潰瘍創(chuàng)面的定向移動，進而影響了創(chuàng)面修復的效果［1-3］。紅景天苷是藏藥紅景天中的活性成分，有研究報道紅景天苷在干細胞的增殖、遷移、分化中起到調控作用［4-7］。脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是組織工程領域重要的種子細胞之一，具有來源廣泛、取材方便等優(yōu)勢，被用于燒傷創(chuàng)面、糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面的治療［8-10］。本研究將紅景天苷用于ADSCs的干預，一方面觀察紅景天苷在高糖環(huán)境下對ADSCs 增殖、遷移及分化的影響，另一方面觀察紅景天苷處理ADCSs 后對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合作用，旨在為今后使用ADSCs治療糖尿病皮膚潰瘍提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物7 ～8 周齡的SPF 級雄性SD 大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，體質量200 ～250 g，許可證號：SCXK（滬）2018-0004。

1.1.2 試劑紅景天苷、鏈脲佐菌素購自Sigma 公司，MTS 細胞增殖活力檢測試劑盒購自Promega 公司，結晶紫購自上海生工公司，RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，HE 染色試劑盒購自上海歌凡生物，CD44、CD29、CD45、CD34、角蛋白19（Cytokerantin19，CK19）、CD31、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、膠原蛋白（Collagen，Col）-Ⅰ、Col-Ⅲ抗體購自Abcam公司。

1.1.3 儀器細胞培養(yǎng)箱購自Thermo 公司，顯微鏡購自Nikon 公司，酶標儀購自Bio-tek 公司，凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ADSCs 的分離及驗證分離大鼠大腿內側腹股溝處的脂肪組織，剔除脂肪組織膜及血管后剪碎，消化酶消化組織后離心得到沉淀，重懸并接種在培養(yǎng)瓶中，24 h 后換液、去除未貼壁的細胞，而后每3 天換液1 次，細胞融合至80% ～90%后進行消化，取第三代細胞，在流式細胞儀上檢測CD44、CD29、CD45、CD34 的表達。

1.2.2 ADSCs 的分組及給藥第3 代ADSCs 隨機分為對照組、高糖組、高糖+紅景天苷組、紅景天苷組，分別用低糖（5.5 mmol/L）DMEM、高糖DMEM（25.0 mmol/L）、含有100 μg/mL 紅景天苷的高糖DMEM、100 μg/mL 紅景天苷的低糖DMEM 處理，每組設置4 個復孔。

1.2.3 ADSCs 增殖的檢測采用MTS 試劑盒檢測細胞活力并在酶標儀上檢測490 nm 波長處的吸光值A490。

1.2.4 ADSCs 遷移的檢測在Transwell 模型中檢測細胞遷移，ADSCs 接種在上層小室內，下層小室內加入含血清培養(yǎng)基，分組干預后2 d 用結晶紫對遷移細胞進行染色，而后在顯微鏡下觀察計數。

1.2.5 動物分組、造模及干預實驗動物隨機分為模型組、ADSCs 組、紅景天苷ADSCs 組，每組各8 只。造模方法如下：高脂高糖飼料喂養(yǎng)1 個月、腹腔注射鏈脲佐菌素誘導糖尿病，在背部正中做一直徑2 cm 創(chuàng)面。造模后6 h 開始進行干預，對照組經尾靜脈注入1 mL 培養(yǎng)基，ADSCs 組經尾靜脈注入1 mL 含有2 × 106個ADSCs 的培養(yǎng)基，紅景天苷ADSCs 組 經尾靜脈注入1 mL 含 有2 × 106個紅景天苷預處理48 h 的ADSCs 的培養(yǎng)基。

1.2.6 創(chuàng)面愈合的大體觀察干預前、及干預后第7 天、第14 天時，觀察創(chuàng)面并拍照，計算創(chuàng)面面積及愈合率。

1.2.7 創(chuàng)面愈合的形態(tài)學觀察干預后第14 天，處死大鼠并收集創(chuàng)面組織，4%多聚甲醛固定后制作切片，采用HE 染色試劑盒進行染色并在顯微鏡下觀察形態(tài)學改變。

1.2.8 蛋白表達的Western blot檢測取分組給藥的ADSCs或干預后第14天的大鼠創(chuàng)面組織，用RIPA裂解液提取蛋白并檢測蛋白含量，取含有30 μg 蛋白的樣本進行Western blot 檢測，電泳、電轉PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉、孵育一抗、二抗后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶，根據灰度值計算表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件錄入數據，計量資料采用均數±標準差表示，采用單因素方差分析進行差異性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ADSCs 表面干細胞標志物的表達第三代ADSCs 表面CD44、CD29 的陽性率均在95%以上，CD45、CD34 陰性表達，表明ADSCs 符合間充質來源干細胞的特性。見圖1。

2.2 紅景天苷促進ADSCs 的增殖與對照組比較，高糖組的A490水平明顯降低，紅景天苷組的A490水平明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+紅景天苷組的A490水平明顯增加（P＜0.05）且在干預的第1 天、第2 天，紅景天苷組及高糖+紅景天苷組的A490水平逐步增加，而從干預的第3 天起、紅景天苷組及高糖+紅景天苷組的A490水平不再繼續(xù)增加，因此后續(xù)選擇紅景天苷干預2 d 作為檢測ADSCs 遷移、分化的時間點。見圖2。

2.3 紅景天苷促進ADSCs 的遷移干預后2 d，對照組、高糖組、高糖+紅景天苷組、紅景天苷組的遷移數目分別為（22.38±6.86）、（11.75±3.47）、（19.75±5.14）、（37.49±9.39）。與對照組比較，高糖組的遷移細胞數目明顯減少，紅景天苷組的遷移細胞數目明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+紅景天苷組的遷移細胞數目明顯增加（P＜0.05）。見圖3。

圖1 ADSCs 表面CD44、CD29、CD45、CD34 的表達Fig.1 Expression of CD44，CD29，CD45 and CD34 on ADSCs

圖2 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 增殖的影響Fig.2 Effect of salidroside on the proliferation of ADSCs under high glucose condition

2.4 紅景天苷促進ADSCs 的定向分化干預后2天，與對照組比較，高糖組的CK19、CD31、α-SMA表達量明顯減少，紅景天苷組的CK19、CD31、α-SMA 表達量明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+紅景天苷組的CK19、CD31、α-SMA 表達量明顯增加（P＜0.05）。見圖4、表1。

圖3 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 遷移的影響Fig.3 Effect of salidroside on the migration of ADSCs under high glucose condition

圖4 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Fig.4 Effect of salidroside on the expression of CK19，CD31，α-SMA in ADSCs under high glucose condition

2.5 紅景天苷預處理ADSCs 移植促進糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的大體觀察及形態(tài)學觀察與模型組比較，ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs 組的創(chuàng)面愈合率均增加（P＜0.05）且紅景天苷+ADSCs 組的創(chuàng)面愈合率高于ADSCs 組（P＜0.05），見表2；HE染色觀察形態(tài)學改變顯示，模型組創(chuàng)面組織中存在大量淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞，新生血管及成纖維細胞減少；ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs組創(chuàng)面組織中成纖維細胞增多、炎癥細胞減少且紅景天苷+ADSCs 組的變化較ADSCs 組更明顯，見圖5。

表1 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Tab.1 Effect of salidroside on the expression of CK19，CD31，α-SMA in ADSCs under high glucose condition ±s

表1 紅景天苷對高糖條件下ADSCs 中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Tab.1 Effect of salidroside on the expression of CK19，CD31，α-SMA in ADSCs under high glucose condition ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與高糖組比較，#P ＜0.05

組別對照組高糖組高糖+紅景天苷組紅景天苷組例數4 4 4 4 CK19 0.78±0.16 0.40±0.09*0.89±0.14*1.19±0.24#CD31 0.69±0.08 0.31±0.07*0.60±0.07*0.93±0.18#α-SMA 0.52±0.09 0.24±0.07*0.58±0.10*0.79±0.14#

表2 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率的影響Tab.2 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on skin wound healing rate in diabetic rats x±s

2.6 紅景天苷預處理ADSCs增加糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中膠原的表達量與模型組比較ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs 組皮膚創(chuàng)面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達量明顯增加（P＜0.05）且紅景天苷+ADSCs 組皮膚創(chuàng)面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達量明顯高于ADSCs組（P＜0.05）。見圖6、表3。

2.7 紅景天苷預處理ADSCs增加糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 的表達量與模型組比較，ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs 組皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 的表達量明顯增加（P＜0.05）且紅景天苷+ADSCs 組皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 的表達量明顯高于ADSCs 組（P＜0.05）。見圖7、表4。

3 討論

ADSCs 是創(chuàng)面修復常用的一類干細胞［11-12］，多項研究報道，高糖環(huán)境顯著抑制ADSCs 的增殖、遷移及分化［13-16］。本研究分離ADSCs 并用高糖培養(yǎng)基處理，結果發(fā)現(xiàn)細胞的增殖、遷移受抑制，表皮、血管內皮、血管平滑肌的標志基因CK19、CD31、α-SMA 表達降低，表明高糖對ADSCs 的增殖、遷移及分化具有抑制作用，與既往其他學者的研究結果吻合。

圖5 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面形態(tài)學的影響（HE 染色，×400）Fig.5 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on skin wound morphology in diabetic rats（HE staining，×400）

圖6 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達的影響Fig.6 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on Col-Ⅰ，Col-Ⅲexpression in skin wound in diabetic rats

圖7 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Fig.7 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on CK19，CD31，α-SMA expression in skin wound in diabetic rats

表3 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達的影響Tab.3 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on Col-Ⅰ，Col-Ⅲexpression in skin wound in diabetic rats x±s

ADSCs 在高糖環(huán)境下的上述變化會直接影響其修復糖尿病潰瘍創(chuàng)面的作用，需要進行必要的干預。國內學者的研究使用白細胞介素8、趨化因子-8 進行干預后，能夠減輕高糖引起的ADSCs 損傷［13-14］；國外學者的研究使用HIF-1α、CDC42 基因修飾的方式減輕了高糖引起的ADSCs 損傷［15-16］。紅景天苷是藏藥紅景天的活性成分，對高糖引起的多種細胞損傷具有保護作用［17-19］。本實驗在高糖環(huán)境下加用紅景天苷對ADSCs 進行處理，結果發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠減輕高糖對ADSCs 增殖、遷移、分化的抑制作用。

表4 紅景天苷預處理ADSCs 移植對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 表達的影響Fig.4 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on CK19，CD31，α-SMA expression in skin wound in diabetic rats±s

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與ADSCs 組比較，#P ＜0.05

組別 例數CK19CD31α-SMA模型組ADSCs 組紅景天苷ADSCs 組8 8 8 0.40±0.09 0.67±0.13*0.93±0.17#0.35±0.07 0.70±0.12*1.04±0.20#0.24±0.05 0.56±0.09*0.94±0.18#

干細胞在創(chuàng)面內的歸巢并向上皮細胞、內皮細胞、平滑肌細胞分化能夠促進創(chuàng)面的修復［20-22］。本實驗在建立糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的模型后進行了ADSCs 的移植，單純移植ADSCs 能夠促進創(chuàng)面愈合、增加創(chuàng)面中的血管內皮細胞及成纖維細胞，而移植紅景天苷預處理的ADSCs 能夠增強上述促愈合作用，且創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 的表達均增加。這一結果表明紅景天苷預處理的ADSCs 具有更強的創(chuàng)面修復能力，紅景天苷可能通過促進ADSCs 增殖、遷移及分化的方式增強ADSCs 的創(chuàng)面修復能力。

綜上所述，紅景天苷對ADSCs 的增殖、遷移、分化具有促進作用，移植紅景天苷預處理的ADSCs 能夠促進糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合，促進ADSCs 增殖、遷移及其向表皮、血管內皮及血管平滑肌分化是可能的分子機制。但是目前關于ADCSs進入體內后增殖、定向分化并分布至潰瘍的機制尚未明確，今后應通過更多的在體外動物實驗來闡明ADCSs 或其他干細胞進入體內后的增殖、分化、遷移過程及相關機制。