劉國玲 薛亦白 江康 徐凱麗

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2心臟外科（鄭州450000）；3南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（河南南陽473000）；4鄭州兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（鄭州450000）

癲癇是一種臨床常見的慢性反復(fù)發(fā)作性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為肌肉抽搐和意識障礙，具有突發(fā)性、短暫性、反復(fù)發(fā)作性等特點(diǎn)［1］。癲癇患者目前主要通過服用藥物來控制癲癇發(fā)作，對于耐藥性癲癇則采取切除致癇灶方式進(jìn)行治療，但藥物難以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，手術(shù)方式易損害神經(jīng)功能，尋找新的治療靶點(diǎn)對改善癲癇患者癥狀具有重要意義［2-3］?？p隙連接（gap junction，GJ）廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)，尤以星形膠質(zhì)細(xì)胞存在較多，由相鄰細(xì)胞膜的縫隙連接蛋白（connexins，Cxs）組成，介導(dǎo)細(xì)胞物質(zhì)和信息交流，與癲癇發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［4］。星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cxs以Cx43表達(dá)最多，在神經(jīng)系統(tǒng)受損后表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)損傷［5］。研究顯示，能量代謝紊亂是癲癇發(fā)生的主要原因之一，癲癇發(fā)作過程中局部腦組織能量代謝降低，神經(jīng)細(xì)胞能量主要來源于葡萄糖代謝，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織協(xié)調(diào)葡萄糖代謝過程中發(fā)揮重要作用［6］。Cx43 在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，但在癲癇模型及其在星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖代謝中的作用研究尚少，本研究通過沉默Cx43，觀察其對癲癇小鼠的改善作用，以及對星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響，旨在探討Cx43 在癲癇中的作用機(jī)制，為臨床治療癲癇提供新靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF 級C57BL/6J 小鼠95 只，8 周齡，體質(zhì)量（20±1）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，購入后控制溫度（22 ± 2）℃，相對濕度（50±5）%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要試劑和儀器東莨菪堿，鹽酸匹魯卡品（美國Sigma 公司），地西泮注射液（國藥準(zhǔn)字H12020957，天津金耀藥業(yè)有限公司，2 mL：10 mg），重組慢病毒（LV-shCx43 和LV-EGFP）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞［澳賽爾斯生物技術(shù)（上海）有限公司］，兔抗小鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體（美國Neomarkers 公司），Cy3 標(biāo)記的驢抗兔IgG（美國Sigma 公司），2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-NBDG）攝取試劑盒（美國Cayman 公司），小鼠腦立體定位儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司），RM6240 生物信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠），IX53 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），Mini-Protean4 電泳儀（美國BioRad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及慢病毒注射取95只小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（20 只）、癲癇組（25 只）、空載組（25 只）和沉默組（25 只）。所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，使用腦立體定位儀固定頭部，沿正中矢狀位切開皮膚，暴露顱骨和前囟，根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜確定海馬齒狀回，使用顱鉆鉆孔，手術(shù)組和癲癇組注射5 μL 生理鹽水，空載組和沉默組分別注射5 μL LV-EGFP 和LV-shCx43，縫合傷口，涂抹碘伏。

1.2.2 建模注射后恢復(fù)7 d，建立癲癇小鼠模型［7］。除假手術(shù)組外，其他各組小鼠腹腔注射2 mg/kg 東莨菪堿，用于拮抗外周膽堿能反應(yīng)，30 min 后，腹腔注射300 mg/kg鹽酸匹魯卡品。觀察小鼠反應(yīng)，根據(jù)Racine量表［8］，評估小鼠癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度，面部抽搐，眨眼、節(jié)律性咀嚼為1分，出現(xiàn)點(diǎn)頭動作為2分，單側(cè)前肢出現(xiàn)陣攣為3 分，雙側(cè)前肢出現(xiàn)陣攣為4分，失去平衡、摔倒為5分。2 h內(nèi)癲癇等級≥3 級，且發(fā)作次數(shù)≥3 次，達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)，視為造模成功。2 h 后按5 mg/kg 體質(zhì)量腹腔注射地西泮，終止癲癇發(fā)作。假手術(shù)組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。最終各組小鼠均有20 只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

建模成功后第1 天開始，根據(jù)腦圖譜定位將腦電圖電極植入顱骨左右額葉（3.5 mm A，2.5 mm L）皮層和枕葉皮層（5 mm P，2.5 mm L），參考電極植入小鼠鼻根部，用牙膏水泥固定電極，置入7 d 后開始監(jiān)測，每組每天各選5 只小鼠，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)各組每分鐘平均放電次數(shù)。

1.2.3 RT-qPCR 檢測小鼠海馬組織Cx43 mRNA表達(dá)造模后5 d，各組隨機(jī)選擇5 只小鼠，處死后取大腦，分離海馬組織，按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：模板cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA 聚合酶10 μL，雙蒸水7 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸60 s，共45 個(gè)循環(huán)。Cx43上游引物：正向：5′-ATGCATCGATAAGCCTAGAT-3′；反向正向：5′-CGTAGACAATGCTGAATGC-3′。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計(jì)算Cx43 mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.4 熒光免疫組織化學(xué)染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞造模后5 d，各組隨機(jī)選擇5 只小鼠，處死取大腦，-80 ℃保存。取保存大腦組織，-20 ℃冠狀位連續(xù)冰凍切片（片厚10 μm）。切片復(fù)溫后于4%多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗15 min×3 次，正常牛血清室溫封閉2 h，滴加兔抗GFAP 一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜，PBS 漂洗15 min×3 次，加入Cy3 標(biāo)記的二抗（1∶100），室溫孵育1 h，PBS 漂洗5 min×3次，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞（Cy3 呈紅色熒光）。

1.2.5 觀察各組小鼠癲癇持續(xù)時(shí)間和頻率造模后10 d 開始錄像觀察，記錄各組植入電極的小鼠≥4 級癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間和頻率，連續(xù)20 d，取平均值。

1.2.6 Cx43 轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞將小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞按1 × 105個(gè)/孔，接種于6 孔板，按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組（轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000）、sh-Cx43 組（轉(zhuǎn)染Cx43-shRNA 質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物）、NC 組（轉(zhuǎn)染Cx43-shRNA-NC 質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物），5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，48 h 后顯微鏡下觀察，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均＞85%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 Western blot檢測細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解2 h，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集上清，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，上樣蛋白，進(jìn)行SDSPAGE 電泳，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 洗膜，加入稀釋的Cx43 一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST 洗膜，將ECL 化學(xué)發(fā)光液滴加于膜上，顯影、定影、拍照。計(jì)算Cx43 蛋白相對表達(dá)水平（以其與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值表示）。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞攝取葡萄糖能力取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，加入25 mmol/L 的2-NBDG，37 ℃孵育1 h，用含2 mmol/L D 型葡萄孵育5 min進(jìn)行競爭性抑制，PBS 洗滌，加入裂解液裂解細(xì)胞，10 000 r/min 離心5 min（離心半徑12 cm），取上清，上流式細(xì)胞儀檢測2-NBDG 表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性表達(dá)率（2-NBDG 表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠海馬組織Cx43 mRNA水平比較假手術(shù)組、癲癇組、空載組和沉默組海馬組織中Cx43 mRNA相對表達(dá)量分別為：（0.36±0.08）、（2.32± 0.18）、（2.28 ± 0.15）、（0.51 ± 0.09），海馬組織中Cx43 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=307.708，P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，癲癇組、空載組和沉默組海馬組織中Cx43 mRNA 相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與癲癇組和空載組比較，沉默組海馬組織中Cx43 mRNA 相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；癲癇組和空載組海馬組織中Cx43 mRNA相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞觀察熒光顯微鏡下顯示，假手術(shù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞形狀規(guī)則，排列整齊；癲癇組GPAP 陽性細(xì)胞明顯增多，突起增多，排列混亂，交織成網(wǎng)狀；空載組與癲癇組細(xì)胞狀態(tài)相似；沉默組GPAP 陽性細(xì)胞較癲癇組和空載組明顯減少。見圖1。

圖1 海馬A3 區(qū)GFAP 陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞（400×）Fig.1 GFAP-positive astrocytes in the hippocampus A3 area（400×）

2.3 各組小鼠腦電監(jiān)測結(jié)果假手術(shù)組腦電波以α、θ為主，波幅均在75 μV以下；癲癇組腦電波表現(xiàn)為棘波、尖波節(jié)律以及復(fù)合波等癲癇樣放電，波幅100 ～1 000 μV；空載組波形與癲癇組相同；沉默組棘波、尖波節(jié)律以及復(fù)合波等癲癇樣放電，頻率較癲癇組明顯降低，波幅在400 μV以下。見圖2。

假手術(shù)組、癲癇組、空載組和沉默組每分鐘平均放電次數(shù)分別為：（18.59 ± 6.68）、（282.19 ±15.57）、（276.45 ± 16.13）、（93.27 ± 10.46）次，每分鐘平均放電次數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 535.133，P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，癲癇組、空載組和沉默組每分鐘平均放電次數(shù)增加（P＜0.05）；與癲癇組和空載組比較，沉默組每分鐘平均放電次數(shù)減少（P＜0.05）；癲癇組和空載組每分鐘平均放電次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和發(fā)作持續(xù)時(shí)間比較發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與癲癇組和空載組比較，沉默組發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間減少（P＜0.05）；癲癇組和空載組發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.5 轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染Cx43-shRNA 和轉(zhuǎn)染Cx43-shRNA-NC 的星形膠質(zhì)細(xì)胞90%以上均有熒光表達(dá)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖3。

2.6 各組細(xì)胞中Cx43 蛋白表達(dá)空白組、NC 組和sh-Cx43 組Cx43 蛋白相對表達(dá)量分別為：（0.56± 0.11）、（0.53 ± 0.10）、（0.28 ± 0.06），細(xì)胞中Cx43蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.794，P＜0.001）。與空白組和NC組比較，sh-Cx43組細(xì)胞中Cx43 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；空白組和NC 組細(xì)胞中Cx43 蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠皮層腦電圖Fig.2 Cortical EEG of rats in each group

表1 各組小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間比較Tab.1 Comparison of the number and duration of seizures in each group of mice ±s

表1 各組小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間比較Tab.1 Comparison of the number and duration of seizures in each group of mice ±s

注：與癲癇組比較，aP ＜0.05；與空載組比較，bP ＜0.05

組別 例數(shù) 發(fā)作次數(shù)（次/d） 發(fā)作持續(xù)時(shí)間（s/次）癲癇組空載組沉默組F 值P 值5 5 5 9.80±1.01 9.60±0.97 5.20±0.83ab 76.531＜0.001 45.26±4.55 43.68±4.47 22.34±3.69ab 90.537＜0.001

2.7 各組細(xì)胞2-NBDG表達(dá)陽性率比較空白組、NC 組和sh-Cx43 組陽性2-NBDG 表達(dá)率分別為（15.68±4.57）%、（16.16±4.25）%、（72.45±7.31）%，2-NBDG 陽性表達(dá)率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=216.489，P＜0.001）。與空白組和NC 組比較，sh-Cx43 組2-NBDG 陽性表達(dá)率升高（P＜0.05）；空白組和NC 組2-NBDG 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果圖（×200）Fig.3 Transfection effect of astrocytes（×200）

3 討論

癲癇是一種腦神經(jīng)元細(xì)胞反復(fù)異常放電引起的腦部疾病，發(fā)作時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)功能短暫性功能失常，反復(fù)或長時(shí)間發(fā)作易使患者神經(jīng)遞質(zhì)過度興奮，進(jìn)而損傷神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)，影響患者認(rèn)知功能［9］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在維持神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮極其重要的作用，癲癇除神經(jīng)元發(fā)生病變外，還伴隨神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能異常［10］?？p隙連接在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞信號傳遞過程中發(fā)揮重要作用，是癲癇發(fā)生發(fā)展內(nèi)在機(jī)制之一，阻滯縫隙連接可抑制癲癇發(fā)作［11］。Cx43 作為縫隙連接的主要蛋白，抑制其表達(dá)可阻滯縫隙連接，推測沉默Cx43 有助于抑制癲癇發(fā)作。故本研究通過沉默Cx43，探討其對癲癇小鼠的治療作用，并進(jìn)一步檢測其對星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖代謝的影響，驗(yàn)證沉默Cx43 的抗癲癇作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［12］。與神經(jīng)元間存在廣泛信息交流，活化后可以釋放營養(yǎng)因子等，通過縫隙連接影響神經(jīng)元微環(huán)境，調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性，從而使神經(jīng)元異常放電，導(dǎo)致癲癇［10］。發(fā)生癲癇后，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，與神經(jīng)元之間連接模式發(fā)生異常，細(xì)胞間信息傳遞功能紊亂，促進(jìn)癲癇發(fā)作［13］。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間通過Cxs 傳遞代謝物和化學(xué)信號，支持神經(jīng)元功能，其中Cx43 在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)最高，是調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度的重要因子［14］。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，特異性阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx43 膜通道，可以減輕體外海馬腦片實(shí)驗(yàn)中的癲癇發(fā)作［15］。動物模擬實(shí)驗(yàn)顯示，使用阻滯Cx43 半通道的模擬肽，可以抑制癲癇小鼠發(fā)作，發(fā)揮抗驚厥作用［16］。本研究癲癇組小鼠海馬組織Cx43 mRNA 表達(dá)較高，經(jīng)沉默Cx43 基因后，小鼠腦平均每分鐘放電次數(shù)、星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量以及癲癇發(fā)作次數(shù)和發(fā)作時(shí)間減少，提示沉默Cx43 表達(dá)，可在一定程度減少癲癇發(fā)作。

星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅對神經(jīng)元有營養(yǎng)、支持、保護(hù)和絕緣作用，同時(shí)參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元能量代謝，對大腦能量傳遞、生產(chǎn)、利用以及存儲等方面發(fā)揮重要作用［17］。哺乳動物大腦對能量需求非常旺盛，神經(jīng)元葡萄糖來源除通過血液循環(huán)直接獲取外，還可以通過星形膠質(zhì)細(xì)胞獲得。星形膠質(zhì)細(xì)胞從血液循環(huán)中獲得的葡萄糖除用于有氧酵解外，剩余葡萄糖以糖原形式儲存，是腦中唯一可以儲存糖原的細(xì)胞，糖原通過降解為神經(jīng)元提供更多能量底物。癲癇發(fā)生發(fā)展與大腦能量代謝失衡有關(guān)，發(fā)生癲癇后，局部神經(jīng)元細(xì)胞缺失，對葡萄糖的利用率降低，癲癇灶出現(xiàn)葡萄糖代謝減低區(qū)［18-19］。本研究為進(jìn)一步明確Cx43 對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，在細(xì)胞水平通過沉默Cx43，結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞對葡萄糖攝取能力明顯提高，提示沉默Cx43 可能通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝，維持神經(jīng)元正常功能，發(fā)揮抗癲癇作用。

本研究從動物模型及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)沉默Cx43，結(jié)果顯示癲癇小鼠臨床癥狀得到明顯改善，并能增加星形膠質(zhì)細(xì)胞對葡萄糖的攝取能力，改善大腦能量代謝，維持神經(jīng)元正常功能，為臨床治療癲癇提供實(shí)驗(yàn)參考。本研究未從動物層面探討Cx43對癲癇小鼠大腦葡萄糖代謝的影響，后續(xù)研究需重點(diǎn)探討，進(jìn)一步驗(yàn)證沉默Cx43 抗癲癇的作用機(jī)制。綜上所述，沉默Cx43 可能通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞葡萄糖代謝，發(fā)揮一定抗癲癇作用。