代艷 包夢(mèng)穎 曾燕玉 劉云 葉雨

1廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院（南寧530007）；2廣西基因組與個(gè)體化醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南寧530022）；3廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科（南寧530021）

巨噬細(xì)胞在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，既往研究表明它除了對(duì)病原體、慢性炎癥、纖維化和癌癥有防御作用，還具有調(diào)節(jié)造血微環(huán)境、影響機(jī)體代謝、介導(dǎo)組織修復(fù)和監(jiān)視胚胎組織的成熟等非免疫作用［1］。巨噬細(xì)胞表型最初被劃分為M1 和M2，其中M1 抗炎及阻止腫瘤進(jìn)展，而M2 發(fā)揮抗炎、組織重塑及免疫抑制，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和侵襲［2］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，有少數(shù)巨噬細(xì)胞表型并不歸屬于傳統(tǒng)的M1 或M2 類(lèi)，在宿主免疫系統(tǒng)中也具有重要功能，包括：腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAMs）、CD169+及TCR+巨噬細(xì)胞，它們分布位置不同，且在不同的疾病發(fā)生發(fā)展中具有各自的功能和特點(diǎn)［2］。TAMs主要是指浸潤(rùn)在腫瘤組織或填充在實(shí)體腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME）中的巨噬細(xì)胞，在腫瘤中受高度關(guān)注。以往認(rèn)為大部分TAMs 極化為M2 型［3］。最近的報(bào)道表明，區(qū)分經(jīng)典極化的抗腫瘤M1 和交替極化的促腫瘤M2 亞型的模型并不能完全解釋體內(nèi)的TAMs 表型多樣性［4］，TAM 的定義及其功能一直頗具爭(zhēng)議。單細(xì)胞技術(shù)可以從單個(gè)細(xì)胞層面研究TAMs 的可塑性及TAMs 與惡性細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)的T 細(xì)胞之間的交互作用，這將為探索潛在的以TAMs 為治療中心的免疫治療提供理論依據(jù)。

1 單細(xì)胞技術(shù)原理及其應(yīng)用

目前常用的單細(xì)胞技術(shù)主要是質(zhì)譜流式技術(shù)（mass cytometry by time-of-flight，CyTOF）和單細(xì)胞RNA 測(cè)序（single-cell mRNA sequencing，scRNAseq），見(jiàn)圖1。CyTOF 可同時(shí)檢測(cè)數(shù)百萬(wàn)單個(gè)細(xì)胞中的40 多個(gè)蛋白標(biāo)記物，既類(lèi)似于低維流式細(xì)胞儀的經(jīng)典分析方法，也類(lèi)似于單細(xì)胞測(cè)序的高維方法，對(duì)于理解TME 復(fù)雜性有幫助［5］。scRNA-seq則提供無(wú)偏見(jiàn)的策略來(lái)描述單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，基于不同平臺(tái)可有很多方法可供選擇，比如使用全長(zhǎng)測(cè)序方法（如Smart-seq2）高敏感度可檢測(cè)到更多的基因數(shù)或3′端測(cè)序方法（如CEL-Seq2和MARS-seq）更少的放大噪音量化了mRNA 水平，以及基于drop 的方法（如Drop-seq、InDrop 和10×Chromium Genomics）［6-7］增加測(cè)序通量。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用于胚胎發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤、免疫、微生物、嵌合體分析等多個(gè)研究領(lǐng)域［8-9］，以及在多組學(xué)上探究單個(gè)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和基因突變，還可用于臨床中腫瘤耐藥機(jī)制的研究，深入理解腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程［10］。目前利用單細(xì)胞技術(shù)探究巨噬細(xì)胞及其亞群標(biāo)記物的文獻(xiàn)總結(jié)見(jiàn)表1。

2 CyTOF 技術(shù)對(duì)TAMs 的特征探索

腫瘤生態(tài)系統(tǒng)可受到細(xì)胞相互作用的影響，而針對(duì)促進(jìn)腫瘤發(fā)展的細(xì)胞間作用的治療策略具有相當(dāng)大的前景。很多研究是針對(duì)耗竭性T 細(xì)胞（Exhausted T cells，TEx）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells ，Tregs）的免疫檢查點(diǎn)進(jìn)行抑制［21］，而T 細(xì)胞的耗竭可被TAMs通過(guò)共刺激受體調(diào)節(jié)。在80%的腫瘤中，至少10%的髓系細(xì)胞為PD-L1+［22］，TAMs可以通過(guò)免疫抑制作用（如PD-L1 表達(dá)）來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤生態(tài)系統(tǒng)［23］。

圖1 scRNA-seq 和CyTOF 技術(shù)的流程和分類(lèi)Fig.1 Flow and classification of SCRNA-SEQ and CyTOF techniques

表1 基于單細(xì)胞技術(shù)定義的巨噬細(xì)胞亞群Tab.1 Macrophage cell subsets identified based on the integrated single-cell studies

LAVIN 等［14］通過(guò)CyTOF 技術(shù)繪制了早期肺腺癌TME 中免疫細(xì)胞的詳細(xì)圖譜，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞主要在腫瘤侵襲邊緣聚集成致密簇，并且高表達(dá)PD-L1，有研究表明TME中PD-L1及TAMs的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的預(yù)后密切相關(guān)［24］。另一項(xiàng)對(duì)人腎臟透明細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn)所有TAMs 表達(dá)促腫瘤（CD206、CD204、CD163）和抗腫瘤（CD169）標(biāo)記物［12］。有一群TAMs 表達(dá)CD38，具有編碼T 細(xì)胞衰竭的PD-1 的配體PDCD1LG2 和CD274 及吸引CD8+T 細(xì)胞和Treg 的趨化因子CCL8和CXCL10的免疫抑制特征，而另兩群TAMs雖與這類(lèi)TAMs 共享大部分特征，但不表達(dá)CD38、無(wú)免疫抑制特征，說(shuō)明CD38在調(diào)控T細(xì)胞活性中的重要作用。又一項(xiàng)對(duì)于人乳腺癌的研究也發(fā)現(xiàn)PD-L1+TAMs 的特征類(lèi)似于腎癌，主要在3 級(jí)腫瘤中富集，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PD-L1+TAM 與Tregs 和PD-1highCTLA-4+CD38+TEx 表型相關(guān)，均表現(xiàn)出免疫抑制且相互作用［17］。HARTER 等［25］研究表明，PD-L1+TAM 的存在與Tregs 的比例有關(guān)，而Tregs 分泌的細(xì)胞因子如IL-10、IL-4 和IL-13，可能會(huì)觸發(fā)免疫抑制特性的TAMs 的發(fā)展［3］。綜上所述，TAMs 與Tregs 之間的細(xì)胞交互作用有希望成為治療方向。

3 利用scRNA-seq技術(shù)對(duì)TAMs特征的探索

最初，CHUNG 等［26］在原位乳腺癌中發(fā)現(xiàn)TAM主要以免疫抑制的M2 特征為主，這種TAM 通過(guò)促進(jìn)血管生成和抑制免疫監(jiān)視來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)展。最近有研究提出TAMs 可共表達(dá)M1 和M2 標(biāo)志物，這一觀念的提出對(duì)傳統(tǒng)的M1 和M2 分類(lèi)方式產(chǎn)生巨大的沖擊，傳統(tǒng)的分類(lèi)方式已經(jīng)無(wú)法體現(xiàn)巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性。

3.1 TAMs 還表現(xiàn)共表達(dá)M1 和M2 相關(guān)基因的特征TME 中的TAMs 具有廣泛異質(zhì)性，MüLLER等［13］在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中以嘌呤能受體（如P2RY12）標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的TAMs，而以CD49D（由ITGA4 編碼）標(biāo)記血源性TAMs，發(fā)現(xiàn)TAMs 共表達(dá)M1 和M2 基因，揭示了血源性TAMs 浸潤(rùn)數(shù)量與低級(jí)別膠質(zhì)瘤存活率呈顯著負(fù)相關(guān)，提出區(qū)分TAMs及針對(duì)免疫抑制血源性TAMs 的治療策略。AZIZI等［11］和LAMBRECHTS 等［27］在乳腺癌和肺癌也發(fā)現(xiàn)TAMs 相似的特征，并為連續(xù)表型，這挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的巨噬細(xì)胞的激活與極化模型，比M1 和M2 狀態(tài)共存的模型更進(jìn)一步揭示這種共表達(dá)特征在很多腫瘤中是共存的。

3.2 10XGenomics 與Smart-seq2 結(jié)合分析腫瘤中TAMs 的特征一些學(xué)者將10XGenomics 與Smartseq2 方法結(jié)合多組織整合分析，既比較兩種方法的綜合分析能力，也從高分辨率角度了解腫瘤中TAMs 的表型及追蹤其在不同組織中的動(dòng)態(tài)。ZHANG 等［19］發(fā)現(xiàn)主要富集于腫瘤組織的骨髓源性抑制細(xì)胞樣巨噬細(xì)胞和TAM 樣巨噬細(xì)胞，其中TAM 樣巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為M1 和M2 特征共存，比經(jīng)典的M1/M2 更加復(fù)雜。它表達(dá)的基因SLC40A1 和GPNMB 與預(yù)后不良有關(guān)，這種TAMs 可能是一種潛在的靶向治療癌癥的候選細(xì)胞。ZHANG 等［20］在結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）中鑒定了兩個(gè)不同的TAMs，包括C1QC+和SPP1+TAMs，這兩個(gè)種群都不符合M1 和M2 的二分體表型。SMILLIE 等［28］發(fā)現(xiàn)在潰瘍性結(jié)腸炎和健康個(gè)體的結(jié)腸黏膜中只有C1QC+TAMs，而促血管生成的SPP1+TAM 僅富集在CRC 患者癌組織中，提示其可能在CRC 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。使用Anti-CSF1R 抑制劑只減少部分C1QC+TAM，保留了SPP1+TAMs，這可能是Anti-CSF1R 單藥治療腫瘤效果不佳的原因。綜上所述，個(gè)性化探索TAMs 在不同的腫瘤中特征和功能可為精準(zhǔn)免疫治療提供線索。

4 單細(xì)胞技術(shù)與RNA 測(cè)序技術(shù)在研究TAMs 中的優(yōu)勢(shì)

RNA 測(cè)序（RNA-seq）［29］是一種基因組方法，通常檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)混合細(xì)胞的總RNA 量來(lái)估計(jì)不同基因的表達(dá)水平，忽視了單個(gè)細(xì)胞間的異質(zhì)性。而scRNA-seq 更關(guān)注細(xì)胞的異質(zhì)性，無(wú)偏性分析可解決TAM的復(fù)雜性。CyTOF和scRNA-seq平臺(tái)是對(duì)正常和腫瘤樣本中復(fù)雜免疫系統(tǒng)的分析，這些研究開(kāi)始系統(tǒng)地揭示不同比例和亞型的免疫細(xì)胞［30］，比如揭示NSCLC 組織中介導(dǎo)單核細(xì)胞向M2 分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［31］。在腫瘤的不同分級(jí)和亞型中識(shí)別鑒定血液來(lái)源及組織駐留的巨噬細(xì)胞的標(biāo)記，比較其標(biāo)記物的差異表達(dá)，以便了解腫瘤中主導(dǎo)的免疫抑制類(lèi)群以及設(shè)計(jì)更有效的精準(zhǔn)治療方法［13］。許濤等［32］分析三陰性乳腺癌（TNBC）中巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)記基因，為T(mén)NBC 患者的靶向與免疫治療提供思路。scRNA-seq 和總RNA-seq聯(lián)合分析TNBC［33］，通過(guò)scRNA-seq 發(fā)現(xiàn)高比例的M2 樣TAMs。再采用bulk RNA-seq 分析TAMs 與生存之間的關(guān)系。采用多種生物信息學(xué)方法建立TAM 相關(guān)基因標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)生存和免疫治療反應(yīng)，為開(kāi)發(fā)新一代TNBC 的免疫療法和精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。研究組織中同類(lèi)型細(xì)胞間的差異性，單細(xì)胞技術(shù)可能是更為合適的研究方式，但傳統(tǒng)的測(cè)序方法也有其價(jià)格及對(duì)樣本的要求低的優(yōu)勢(shì)，需根據(jù)自身的研究需要合理選擇適合的研究方法。

5 單細(xì)胞技術(shù)的不足

CyTOF 依賴(lài)多種抗體，無(wú)法區(qū)分腫瘤組織、健康鄰近組織和血管特異性免疫細(xì)胞表型。scRNAseq 也存在限制和條件，首先是可能產(chǎn)生因?qū)嶒?yàn)重復(fù)在不同時(shí)間或從不同平臺(tái)生成的數(shù)據(jù)等引起的批次效果［34］；其次是基于drop 的測(cè)序方法每個(gè)細(xì)胞只能捕獲小部分轉(zhuǎn)錄組；而且有時(shí)mRNA 與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平不一致。此外，組織消化會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激，改變某些基因的表達(dá)和細(xì)胞表面分子；組織樣本取材不同和解離過(guò)程，導(dǎo)致獲取的表達(dá)信息不能映射到解剖位置或者細(xì)胞結(jié)構(gòu)。因此，單細(xì)胞技術(shù)需要克服它的局限性，將TME 的細(xì)胞、分子和結(jié)構(gòu)信息結(jié)合展現(xiàn)。

6 總結(jié)與展望

本綜述討論了利用單細(xì)胞技術(shù)在不同腫瘤組織中對(duì)巨噬細(xì)胞群體的探究，更好地了解在不同腫瘤中巨噬細(xì)胞的表型和功能多樣性。它們與疾病、患者的臨床特征和未來(lái)事件的關(guān)系可能有助于理解疾病的發(fā)病機(jī)制及為腫瘤未來(lái)的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。此外，在未來(lái)的人類(lèi)腫瘤研究中，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集與臨床數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，包括病灶特征（如細(xì)胞含量及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度、浸潤(rùn)部位）、腫瘤分期等，而且應(yīng)進(jìn)一步描述巨噬細(xì)胞亞群。應(yīng)用本綜述中描述的不同組織中巨噬細(xì)胞類(lèi)群及一系列標(biāo)記物，未來(lái)CyTOF 實(shí)驗(yàn)可能證實(shí)并詳細(xì)說(shuō)明巨噬細(xì)胞群體在人腫瘤中的存在及功能。此外，亞群特異性標(biāo)記也可以應(yīng)用于區(qū)分群體的不同狀態(tài)和隨后具有詳細(xì)特征的細(xì)胞表型。未來(lái)可結(jié)合scATAC-seq（染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)）和scCHIP-seq（特定組蛋白標(biāo)記）對(duì)表觀基因組景觀進(jìn)行研究，以進(jìn)一步揭示特異巨噬細(xì)胞亞群及它們的調(diào)控途徑，如表觀遺傳過(guò)程和控制它們的轉(zhuǎn)錄因子。

總之，未來(lái)單細(xì)胞技術(shù)的方向?qū)⑹菃渭?xì)胞多組學(xué)分析，可從同一個(gè)單細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和表觀基因組，分析細(xì)胞的異質(zhì)性、疾病轉(zhuǎn)移的分子特征、細(xì)胞間的相互作用，比較不同疾病階段和治療前后免疫細(xì)胞亞群之間的基因表達(dá)和分化途徑的差異。此外，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)可還原單個(gè)細(xì)胞的解剖信息。因此，可以繪制腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞動(dòng)態(tài)工作的圖譜，這將是改進(jìn)免疫療法和支持新療法發(fā)展的第一步，將為加速這一方向的研究提供有價(jià)值的資源。