胡偉嬌 婁江濤 周俊 殷一紅

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種病因復(fù)雜，影響人體生殖、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的異質(zhì)性疾病，在青春期及育齡期婦女中發(fā)病率達(dá)5%～10%[1]。PCOS病因復(fù)雜，至今仍不明確，但患者血清中常有多種自身抗體存在，提示自身免疫反應(yīng)可能是PCOS發(fā)病的一個(gè)因素。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（antithyroid peroxidase autoantibody，TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（anti-thyroglobulin antibody，TGAb）在PCOS患者血清中顯著升高[2-3]。這些抗體是診斷自身免疫性甲狀腺炎的特異性抗體，長(zhǎng)期存在最終可導(dǎo)致甲狀腺功能受損，而甲狀腺功能異常會(huì)影響女性垂體性腺軸及卵巢功能，加重PCOS的病情。T細(xì)胞亞群的正常分布對(duì)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)有重要意義，T細(xì)胞亞群失衡與多種自身免疫性疾病有關(guān)[4-5]。另外，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量與功能降低亦是造成自身免疫性疾病發(fā)生的重要原因[6]?；诖?，本研究擬通過(guò)觀察PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者外周血T細(xì)胞亞群分布情況和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量與功能，探討外周血T細(xì)胞亞群及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者發(fā)病中的作用，以期為其臨床診治提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年3月至2018年12月寧波市中醫(yī)院婦科就診的PCOS和PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者各50例。PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：（1）稀發(fā)排卵或無(wú)排卵；（2）高雄激素的臨床體征和（或）生化證據(jù)；（3）多囊卵巢。其中稀發(fā)排卵指月經(jīng)周期≥35 d或每年月經(jīng)次數(shù)＜9次；無(wú)排卵指月經(jīng)周期超過(guò)3個(gè)月、閉經(jīng)或功能失調(diào)性子宮出血病；多囊卵巢指超聲檢查單側(cè)或雙側(cè)卵巢內(nèi)可見(jiàn)直徑2～9 mm的卵泡≥12個(gè)和（或）卵巢體積＞10 ml。上述3項(xiàng)有任意2項(xiàng)即可診斷。同時(shí)PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者需同時(shí)滿足 TPOAb＞9.0 U/ml和（或）TGAb＞4.0 U/ml且甲狀腺功能無(wú)異常。所有患者均為初診，未經(jīng)治療，并除外先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、庫(kù)欣綜合征、分泌雄激素的腫瘤等可導(dǎo)致高雄激素血癥的原因。另?yè)裢趤?lái)本院進(jìn)行健康體檢的已婚健康女性50例為正常對(duì)照組，及體檢TPOAb＞9.0 U/ml和（或）TGAb＞4.0 U/ml且甲狀腺功能及其它癥狀體征無(wú)異常者50例為單純甲狀腺抗體陽(yáng)性組。PCOS組[（29.95±4.60）歲]、PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組[（31.31±4.30）歲]、甲狀腺抗體陽(yáng)性組[（31.37±6.20）歲]及正常對(duì)照組[（30.67±4.20）歲]年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀DXI-800型及配套試劑和全自動(dòng)生化分析儀AU5821型及配套試劑均購(gòu)自美國(guó)BACKMAN公司。全自動(dòng)糞便分析儀AVE-562及配套試劑均購(gòu)自長(zhǎng)沙愛(ài)威科技有限公司。熒光定量PCR儀Mx3000P型購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司，普通PCR儀購(gòu)自德國(guó)Roche公司，總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及RT-PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司。流式細(xì)胞儀Navios型，熒光抗體CD3-PC5、CD4-RD1、CD8-ECD 和 CD25-PE 均購(gòu)自美國(guó)BACKMAN公司。

1.2.2 標(biāo)本采集 所有受試者均在月經(jīng)周期的第3～5天時(shí)抽取空腹肘靜脈血5 ml，分離血清后測(cè)定性激素、胰島素和葡萄糖；同時(shí)抽取EDTA抗凝血5 ml，其中1 ml用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，其余4 ml采用Ficoll密度梯度離心法收集外周血單個(gè)核細(xì)胞，用于總RNA的提取。

1.2.3 BMI測(cè)算 測(cè)量身高和體重，BMI在18.5～22.9為正常體重，BMI≥23.0為超重，BMI＞25.0為肥胖。

1.2.4 胰島素抵抗指數(shù)（homeostasism odela ssessment of insulin resistance，HOMA-IR）測(cè)算 通過(guò)穩(wěn)態(tài)模型法計(jì)算 HOMA-IR，HOMA-IR=[空腹胰島素（mU/L）×空腹血糖（mmol/L）]/22.5。HOMA-IR ≥2.69判定為胰島素抵抗。葡萄糖及胰島素分別采用全自動(dòng)生化分析儀和免疫發(fā)光儀及配套試劑盒測(cè)定。

1.2.5 生殖內(nèi)分泌激素、甲狀腺特異性抗體及血糖測(cè)定 采用全自動(dòng)免疫發(fā)光儀及配套試劑盒測(cè)定卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）、睪酮（yestosterone，T）、TPOAb和 TGAb。

1.2.6 糞便球桿菌比測(cè)算 采用全自動(dòng)糞便分析儀檢測(cè)糞便球菌和桿菌，并計(jì)算其比值。

1.2.7 T細(xì)胞亞群檢測(cè) 取EDTA抗凝外周血0.5 ml，加入CD3-PC5、CD4-RD1、CD8-ECD和 CD25-PE各5 μl，室溫避光孵育15 min，置溶血儀中溶血，然后加入2 ml PBS洗滌離心后棄上清液。用500 μl PBS重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析T細(xì)胞亞群。

1.2.8 IFN-γ、IL-4和叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（fork head box protein p3，F(xiàn)oxp3）mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA提取采用Trizol法，具體按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。提取的總RNA經(jīng)DU800紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值在1.8～2.0用于后續(xù)試驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所需引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成，序列見(jiàn)表1。20 μl PCR反應(yīng)體系中含有上游引物900 nmol/L，下游引物 300 nmol/L，cDNA 2 μl，Universal Master Mix 10 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min，再用二步法進(jìn)行擴(kuò)增：94℃ 10s，60℃ 30 s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。計(jì)算目的基因 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為 2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。Foxp3 mRNA表達(dá)水平與各指標(biāo)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組受試者 BMI、HOMA-IR、LH/FSH、T、糞便球桿菌比、TPOAb、TGAb比較 與正常對(duì)照組相比，甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者除糞便球桿菌比、TPOAb和TGAb有所升高（均P＜0.05）外，其余各指標(biāo)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；PCOS組及PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者 BMI、HOMA-IR、LH/FSH、T 及糞便球桿菌比均升高（均P＜0.05）。與甲狀腺抗體陽(yáng)性組相比，PCOS組及PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者BMI、HOMAIR、LH/FSH 及 T均升高（均 P＜0.05），而 PCOS組糞便球桿菌比降低（P＜0.05）。PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組與甲狀腺陽(yáng)性組在糞便球桿菌比、TPOAb及TGAb比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。與PCOS組相比，PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者除T無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05） 外，BMI、HOMA-IR、LH/FSH 及球桿菌比均升高（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 4 組受試者 BMI、HOMA-IR、LH/FSH、T、糞便球桿菌比、TPOAb、TGAb 比較

2.2 4組受試者外周血T細(xì)胞亞群比較 與正常對(duì)照組相比，PCOS組、PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組和甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者的CD4+T細(xì)胞比例及CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值均升高（均P＜0.05），CD8+T細(xì)胞比例降低（均P＜0.05）。與甲狀腺抗體陽(yáng)性組相比，PCOS患者組CD4+T細(xì)胞比例、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值及CD8+T細(xì)胞比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），而PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者CD4+T細(xì)胞比例、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值均升高（均P＜0.05），而CD8+T細(xì)胞比例有所降低（P＜0.05）。另外與正常對(duì)照組相比，PCOS組、甲狀腺抗體陽(yáng)性組和PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例均降低（均P＜0.05），同時(shí)與PCOS組患者相比，甲狀腺抗體陽(yáng)性組和PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例降低更為明顯（均P＜0.05），而甲狀腺抗體陽(yáng)性組和PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 4組受試者外周血T細(xì)胞亞群比較

2.3 4組受試者外周血IFN-γ、IL-4和Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組相比，甲狀腺抗體陽(yáng)性組、PCOS組及PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者IFN-γ mRNA和Foxp3 mRNA表達(dá)均下調(diào)（均P＜0.05），IL-4 mRNA表達(dá)均上調(diào)（均P＜0.05）。與PCOS組相比，PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者IFN-γ mRNA和Foxp3 mRNA表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05），IL-4 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 4組受試者外周血IFN-γ、IL-4和Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較

2.4 PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者Foxp3 mRNA表達(dá)水平與各指標(biāo)的相關(guān)性 PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者 Foxp3 mRNA 表達(dá)水平與 HOMA-IR、BMI、LH/FSH、CD4+T 細(xì)胞/CD8+T 細(xì)胞、IL-4 mRNA、TPOAb、TGAb和糞便球桿菌比均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），而與IFN-γ 呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者Foxp3 mRNA表達(dá)水平與各指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

PCOS是育齡期婦女常見(jiàn)的一種內(nèi)分泌代謝異常性疾病，典型臨床表現(xiàn)為月經(jīng)異常、高雄激素以及卵巢多囊性改變等，同時(shí)多數(shù)伴隨以胰島素抵抗為核心的代謝綜合征。其發(fā)病原因涉及遺傳、心理、代謝、免疫等多種因素。由于PCOS患者血清中?？蓹z測(cè)出多種自身抗體，如組織特異性抗體TGAb、TPOAb和促甲狀腺激素受體抗體，以及組織非特異性如抗核抗體、抗Sm抗體、抗組蛋白抗體等。因此目前有不少觀點(diǎn)認(rèn)為，PCOS是一種自身免疫性疾病，與自身免疫狀態(tài)密切相關(guān)但機(jī)制尚未明確。正常免疫應(yīng)答過(guò)程依賴于各種免疫細(xì)胞，特別是各T細(xì)胞亞群之間的相互協(xié)調(diào)和相互制約，外周血中的T細(xì)胞分為CD4+和CD8+兩個(gè)主要亞群。CD4+T細(xì)胞為T(mén)h，可分化為不同的亞型，調(diào)節(jié)不同的免疫反應(yīng)類型。CD8+T細(xì)胞稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，對(duì)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（MHCⅠ）類抗原的靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒等作用。正常情況下CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和比例是反映細(xì)胞免疫平衡與否的敏感指標(biāo)[8]。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了外周血T細(xì)胞分化情況，結(jié)果顯示甲狀腺抗體陽(yáng)性組、PCOS組和PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者外周血CD4+T細(xì)胞比例及CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞較正常對(duì)照組顯著升高；同時(shí)，PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組較PCOS組患者外周血CD4+T細(xì)胞比例及CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞升高，提示PCOS組和PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者存在Th異常升高為主的淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)。另外，與甲狀腺抗體陽(yáng)性組相比，PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者CD4+T細(xì)胞比例、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞均明顯增高，而CD8+T細(xì)胞比例亦明顯降低。提示PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)更為顯著。

Th在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用，其激活后主要分為T(mén)h1和Th2，分別在細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。正常情況下，Th1/Th2因子呈動(dòng)態(tài)平衡，而平衡遭到破壞常預(yù)示著免疫功能紊亂，研究表明多種自身免疫疾病都涉及到Th1/Th2失衡狀態(tài)[9-10]。Th1 主要分泌 IL-2、IL-12、IL-15、TNF-α 和 IFN-γ 等，而 Th2 主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-13等。本研究通過(guò)觀察Th1和Th2的效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況來(lái)分析其在PCOS和PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者機(jī)體中的狀態(tài)。結(jié)果顯示，PCOS患者IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組相比均明顯上調(diào)，而PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者IFN-γ mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯下調(diào)，相反，IL-4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。同時(shí)與甲狀腺陽(yáng)性組相比，PCOS合并甲狀腺抗體組患者IFN-γ mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組下調(diào)更為明顯。相反，IL-4 mRNA表達(dá)上調(diào)亦更加明顯，提示甲狀腺抗體陽(yáng)性患者、PCOS患者及PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者機(jī)體均存在Th向Th2向分化偏移現(xiàn)象，而PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者偏移更為嚴(yán)重。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是目前研究較多的CD4+T細(xì)胞亞型，是正常人和動(dòng)物T細(xì)胞庫(kù)的一個(gè)組成部分，具有抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的功能，在自身免疫耐受中起重要作用[11]。研究顯示，正常小鼠去除CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后可引起多種自身免疫性疾病如睪丸炎、卵巢炎、炎性腸病、1型糖尿病及甲狀腺炎等，而移植CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能有效預(yù)防這些疾病的發(fā)生[12-13]。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，特異地表達(dá)于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并對(duì)該型細(xì)胞的發(fā)育和功能狀態(tài)起關(guān)鍵作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，甲狀腺抗體陽(yáng)性組、PCOS組和PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例和Foxp3 mRNA表達(dá)水平均降低；與甲狀腺抗體陽(yáng)性組相比，PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性組患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例和Fopx3 mRNA表達(dá)降低更為明顯，提示外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和功能降低可能是PCOS患者易合并發(fā)生自身免疫性疾病的原因之一。同時(shí)通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3 mRNA 與 HOMA-IR、BMI、LH/FSH、CD4/CD8、IL-4、TPOAb、TGAb和糞便球桿菌比均呈負(fù)相關(guān)，提示PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者的胰島素抵抗、月經(jīng)失調(diào)、T細(xì)胞亞群失調(diào)等癥與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能狀態(tài)存在密切聯(lián)系，而Foxp3 mRNA與糞便球桿菌比呈負(fù)相關(guān)則說(shuō)明腸道菌群失調(diào)可能是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能降低的原因之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞及Th1/Th2均存在失衡狀態(tài)，同時(shí)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能降低，但他們之間是否存在因果關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。通過(guò)糾正CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能狀態(tài)或可是治療PCOS合并甲狀腺抗體陽(yáng)性患者的新思路。