王佳 余緒明 于慧斌 石金敏 余世榮

孤兒細(xì)胞色素P450酶系（Orphans Cytochrome P450，CYPs）約占人源的總CYPs的1/4[1]。而孤兒CYPs主要存在于CYP1～4家族，其中CYP4家族占比較大。人源的CYP4X1最初于2002年被發(fā)現(xiàn)并命名，它是CYP4新的亞家族成員，也是重要的孤兒CYPs之一[2]。目前，關(guān)于CYP4X1的研究不多，現(xiàn)有的研究揭示了CYP4X1的結(jié)構(gòu)、分布、表達(dá)調(diào)控及功能[3]，此外還闡明了其在各物種間表達(dá)的同源性蛋白分析[4-7]。CYP4X1廣泛存在于人體各組織內(nèi)，其中在腦、肺、腎、肝、胰腺和前列腺內(nèi)呈高表達(dá)，全腦的表達(dá)量是肝的2～3倍，小腦和杏仁核的表達(dá)量分別是肝的3倍和20倍[8]。眾多研究表明CYP4X1的表達(dá)存在晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、性別差異以及年齡差異[6，9-11]。Savas等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在人肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)，過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）的激動(dòng)劑Wy14643可誘導(dǎo)其表達(dá)，提示PPARα的激活可能影響了人源CYP4X1的轉(zhuǎn)錄。此外，研究表明CYP4X1參與了內(nèi)源性物質(zhì)的代謝、參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和與腫瘤密切相關(guān)等[13-22]。然而，CYP4X1與炎癥之間的關(guān)系如何，在神經(jīng)炎癥環(huán)境下，CYP4X1的表達(dá)調(diào)控是否受到影響，其調(diào)控的分子機(jī)制如何，鮮有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究在神經(jīng)炎癥條件下探討CYP4X1的表達(dá)及其分子機(jī)制，擬采用神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，給予細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）構(gòu)建離體細(xì)胞的炎癥模型，探究CYP4X1在炎癥環(huán)境下的表達(dá)情況及采用人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶分析實(shí)驗(yàn)探究其調(diào)控的分子機(jī)制，以期為闡明CYP4X1與神經(jīng)炎癥之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 FBS（杭州四季青生物公司，批號(hào)：2104）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Thermofisher公司，批號(hào)：10569044）；opti-MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：31985-070）；青霉素-鏈霉素雙抗溶液 100X（美國(guó)Thermofisher公司，批號(hào)：15140122）；EpiQuikTM染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒（美國(guó)Epigentek公司，批號(hào)：P-2002-2）；雙熒光素酶分析試劑盒（美國(guó)promega公司，批號(hào)：E1910，Lot.220597）；脂質(zhì)體 2000（美國(guó) Thermofisher公司，批號(hào)：11668027）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596018,）；LPS 500×（美國(guó) Invitrogen 公司，批號(hào)：00-4976-93）；DNA Ladder（碧云天生物公司，批號(hào)：D0107）；瓊脂糖（美國(guó) Sigma公司，批號(hào)：A9539）；SYBR Premix EX Taq（日本 TAKARA 公司，批號(hào)：DRR041A）；I-5TM2X High Fidelity Master Mix（Molecular Cloning Laboratones，批號(hào)：I5HM-200）；All-in-one cDNA Synthesis SuperMix（美國(guó) Biotool公司，批號(hào)：B24403）；GoldViewⅡ型核酸染色劑（5000×）（北京索萊寶公司，批號(hào)：G8142）；Toll樣受體 4（Toll like receptor 4，TLR4）抑制劑 CLI-095（美國(guó) InvivoGen 公司，批號(hào)：tlrl-cli95）；髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抑制劑 ST 2825（美國(guó) Medchem Express公司，批號(hào)：HY-50937）；膠回收試劑盒（美國(guó)BiomiGA公司，批號(hào)：122131-2）；AxyPrep質(zhì)粒DNA小劑量試劑盒（美國(guó)AxyGEN公司，批號(hào)：AP-MN-P-4）；空載pDONR223質(zhì)粒（湖南優(yōu)寶生物公司），人源的過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ（NM_138712）cDNA克隆質(zhì)粒（湖南優(yōu)寶生物公司，批號(hào)G111467）和人源的核受體視黃醛X受體α（retinoid-X receptor alpha，RXRα）（NM_002957）cDNA 克隆質(zhì)粒（G111467，湖南優(yōu)寶生物公司）；pGL4.11[luc2P]質(zhì)粒（VT1728，湖南優(yōu)寶生物公司）；CYP4X1-pGL4.11[luc2P]報(bào)告質(zhì)粒（武漢思特進(jìn)科技發(fā)展有限公司）；U251細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞293T（武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院樂(lè)江教授實(shí)驗(yàn)室）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U251細(xì)胞和293T細(xì)胞分別于DMEM（含10%FBS，1%雙抗）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。六孔板內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)，將完全培養(yǎng)基棄去，PBS沖洗1～2次，更換無(wú)血清培養(yǎng)基給藥或其他操作。

1.2.2 Real-Time RT-PCR檢測(cè)CYP4X1和PPARγ的表達(dá) U251細(xì)胞分別給予LPS（0.1和1 μg/ml）處理；U251細(xì)胞先分別給予CLI-095（1 μmol/L）和ST 2825（20 μmol/L）預(yù)處理 1 h 后接著添加 LPS（1 μg/ml），連續(xù)培養(yǎng)至24 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用Trizol法抽提取U251細(xì)胞取的總RNA，并測(cè)定其濃度（A260/A280）。加入All-in-one cDNA Synthesis SuperMix按如下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣本，25℃,10 min；42℃，30 min；85℃，5 min。qRT-PCR擴(kuò)增基因，人源CYP4X1上游引物5'-ACAAACAGCACCCATGATCCT-3'，下游引物5'-ACACTCGGCTTAACTTCTGGA-3'；人源的 PPARγ 上游引物5'-GGGATCAGCTCCGTGGATCT-3'，下游引物5'-TGCACTTTGGTACTCTTGAAGTT-3'；人 源 的 CYP4X1（ChIP）上游引物 5'-TAGAACTGTCCAAGCCTCAG-3'，下游引物 5'-TCCTCTATGCCCTATTCCTC-3'；人源的GAPDH上游引物5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，下游引物 5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'；qRTPCR 的擴(kuò)增體系：目的基因 cDNA 2 μl，SYBR mix 5 μl，forwardprimer 0.3 μl，reverseprimer 0.3 μl，DEPC H2O 2.4 μl；Bio-rad RT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)置反應(yīng)條件為95℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。

1.2.3 U251細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人源的PPARγ/RXRα表達(dá)質(zhì)粒 U251細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組：空載組（pDONR223質(zhì)粒）和轉(zhuǎn)染組（人源PPARγ/RXRα表達(dá)）。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染體系為質(zhì)粒 DNA 濃度 1 μg：Lipo2000 3 μl，分別用250 μl opti-MEI優(yōu)化培養(yǎng)稀釋并配置成Mix液，室溫孵育放置10～20 min，加無(wú)血清培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。qRT-PCR檢測(cè)CYP4X1的表達(dá)水平。

1.2.4 雙熒光素酶分析實(shí)驗(yàn) 通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析，將CYP4X1啟動(dòng)子上預(yù)測(cè)含有PPARγ/RXRα結(jié)合位點(diǎn)（與起始密碼子ATG的位置-1971至-1951 bp）的片段（與起始密碼子ATG的位置-2066至-1763 bp，共303bp）插入pGL4.11質(zhì)粒中構(gòu)建CYP4X1-pGL4.11[luc2P]報(bào)告質(zhì)粒。報(bào)告質(zhì)粒的合成由武漢思特進(jìn)科技發(fā)展公司提供。293T細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組。對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載pDONR223質(zhì)粒+CYP4X1-pGL4.11[luc2P]報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染組則為人源PPARγ/RXRα表達(dá)質(zhì)粒+CYP4X1-pGL4.11[luc2P]報(bào)告質(zhì)粒。按照Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒和雙熒光素酶分析試劑盒說(shuō)明操作，每組平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔，ModulusTM單管型多功能檢測(cè)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.2.5 免疫共沉淀分析實(shí)驗(yàn) 在U251細(xì)胞內(nèi)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（DMSO 處理）、LPS（1 μg/ml）組、LPS+CLI-095（1 μmol/L）組和 LPS+ST 2825（20 μmol/L）組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按照ChIP試劑盒提供的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)整每皿U251細(xì)胞密度為2×106～2×107/ml，按上述分組分別處理，細(xì)胞計(jì)數(shù)，1%甲醛溶液固定，室溫孵育10 min。加入1 ml的1.25 mol/L的甘氨酸終止交聯(lián)。超聲處理DNA，將其打碎成500～1 000 bp的片段。測(cè)定染色質(zhì)濃度，將大約10%的染色質(zhì)預(yù)留作為Input處理。10 μg的ChIP級(jí)單克隆小鼠抗人PPARγ抗體和使用正常的小鼠IgG（ChIP試劑盒提供）作為陰性對(duì)照?；厥彰庖叱恋淼腄NA，使用PCR純化試劑盒(美國(guó)Axygen公司)純化，使用qRT-PCR擴(kuò)增Input樣本中的DNA以及從沉淀復(fù)合物中分離得到的DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上分離，使用Auto Chemi成像系統(tǒng)對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4/MyD88信號(hào)通路介導(dǎo)LPS抑制U251細(xì)胞CYP4X1和PPARγ的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，LPS（0.1、1 μg/ml）劑量依賴性抑制U251細(xì)胞CYP4X1和PPARγ的表達(dá)；CYP4X1的表達(dá)下調(diào)分別為 38.60%（P＜0.05）、59.90%（P＜0.05），見(jiàn)圖1a；PPARγ 的表達(dá)下調(diào)分別為 25.17%（P＜0.05）、44.44%（P＜0.05），見(jiàn)圖1b。與空白對(duì)照相比，LPS（1 μg/ml）明顯抑制了U251細(xì)胞CYP4X1和PPARγ的表達(dá)，分別下調(diào) 56.92%（P＜0.05）和 46.24%（P＜0.05）。與空白對(duì)照相比，TLR4抑制劑CLI-095（1 μmol/L）對(duì)CYP4X1和PPARγ的表達(dá)無(wú)影響（均P＞0.05）；與單用LPS比較，CLI-095聯(lián)用LPS明顯衰減了LPS對(duì)CYP4X1和PPARγ表達(dá)的抑制作用，上調(diào)倍數(shù)分別為0.9772倍（P＜0.05）和0.3359倍（P＜0.05），見(jiàn)圖1c、d。與空白對(duì)照相比，MyD88 抑制劑 ST 2825（20 μmol/L）對(duì) CYP4X1和PPARγ的表達(dá)無(wú)影響（均P＞0.05）；與單用LPS比較，ST 2825聯(lián)用LPS部分衰減了LPS對(duì)CYP4X1和PPARγ表達(dá)的抑制作用，上調(diào)倍數(shù)分別為0.5615倍（P＜0.05）和 0.2692倍（P＜0.05），見(jiàn)圖1e、f。即 LPS 主要作用于TLR4/MyD88信號(hào)通路進(jìn)而抑制U251細(xì)胞CYP4X1和PPARγ的表達(dá)。

圖1 不同劑量脂多糖（LPS）以及CLI-095和ST 2825處理U251細(xì)胞后細(xì)胞色素P450 X1（CYP4X1）和過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）表達(dá)情況比較（*P＜0.05）

2.2 PPARγ在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)下游靶基因CYP4X1的表達(dá) U251細(xì)胞瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染PPARγ和RXRα表達(dá)質(zhì)粒，與空載組比較，轉(zhuǎn)染組CYP4X1的表達(dá)水平上調(diào)6.62倍（P＜0.05），見(jiàn)圖2，即CYP4X1可能是 PPARγ 的下游靶基因。293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染含有CYP4X1啟動(dòng)子片段（與起始密碼子ATG的距離-2066至-1763 bp）的報(bào)告基因質(zhì)粒、PPARγ和RXRα表達(dá)質(zhì)粒，與空載組比較，轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度上調(diào)9.63倍（P＜0.05），見(jiàn)圖3，即U251細(xì)胞內(nèi)，PPARγ和RXRα可能形成異源二聚體結(jié)合在CYP4X1啟動(dòng)子（與起始密碼子ATG的位置-1971至-1951 bp）上，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控其表達(dá)。

圖2 U251細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）的表達(dá)情況（與空載組比較，*P＜0.05）

圖3 293T細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）與細(xì)胞色素 P450 X1（CYP4X1）啟動(dòng)子結(jié)合情況（*P＜0.05）

2.3 LPS通過(guò)TLR4/MyD88信號(hào)通路抑制U251細(xì)胞PPARγ蛋白與CYP4X1啟動(dòng)子的結(jié)合 與空白對(duì)照相比，LPS抑制U251細(xì)胞PPARγ蛋白與CYP4X1啟動(dòng)子的結(jié)合，下調(diào) 65.77%（P＜0.05）；與單用 LPS相比，CLI-095顯著衰減LPS對(duì)PPARγ蛋白與CYP4X1啟動(dòng)子結(jié)合的抑制作用，上調(diào)1.35倍（P＜0.05）。與單用LPS相比，ST 2825部分衰減LPS對(duì)PPARγ蛋白與CYP4X1啟動(dòng)子結(jié)合的抑制作用，上調(diào)0.86倍（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 脂多糖（LPS）對(duì)U251細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體 γ（PPARγ）與細(xì)胞色素 P450 X1（CYP4X1）啟動(dòng)子結(jié)合的抑制作用（*P＜0.05）

3 討論

TLR4是哺乳動(dòng)物Toll樣受體家族成員之一。MyD88是一種胞質(zhì)可溶性蛋白，并且是TLR/MyD88/NF-κB信號(hào)通路中一個(gè)重要的接頭蛋白分子，即關(guān)鍵信號(hào)適配器。TLR4特異性識(shí)別LPS，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。研究顯示細(xì)胞內(nèi)主要存在兩條TLR傳導(dǎo)途徑：一種是由MyD88銜接蛋白介導(dǎo)的MyD88信號(hào)通路；另一種是非依賴性MyD88信號(hào)通路[23]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在U251細(xì)胞中，LPS劑量依賴性抑制CYP4X1的表達(dá)，且TLR4/MyD88信號(hào)通路介導(dǎo)了這種抑制作用。

PPARγ是一種配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核激素受體超家族成員。PPARγ調(diào)控靶基因表達(dá)的機(jī)制是，其首先與核受體視黃醛X受體（RXR）如RXRα形成異源二聚體（PPARγ/RXRα），并與輔抑制因子結(jié)合成復(fù)合物，使PPARγ處于失活狀態(tài)。當(dāng)特異性配體與PPARγ結(jié)合后，使PPARγ/RXRα二聚體空間構(gòu)象發(fā)生改變，與輔抑制因子發(fā)生脫離和去抑制，并且募集輔激活因子，再與某些基因起始密碼子上游的過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)控該基因的表達(dá)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，U251細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)PPARγ，結(jié)果CYP4X1的表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)合生物信息學(xué)軟件、雙熒光素酶分析實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀分析實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PPARγ/RXRα結(jié)合于CYP4X1啟動(dòng)子區(qū)域的過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)CYP4X1的表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示神經(jīng)炎癥條件下CYP4X1的表達(dá)及其分子機(jī)制，即在U251細(xì)胞內(nèi)LPS通過(guò)TLR4/MyD88信號(hào)通路抑制了PPARγ與CYP4X1啟動(dòng)子上過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件的結(jié)合，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上抑制了CYP4X1的表達(dá)。然而，本研究?jī)H在轉(zhuǎn)錄水平上闡明了LPS抑制CYP4X1表達(dá)的分子機(jī)制，尚缺乏翻譯后的蛋白質(zhì)水平數(shù)據(jù)，后續(xù)或可設(shè)計(jì)在體大鼠神經(jīng)炎癥模型，進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論。