張聞雯 鄧再興 陳莉萍 賴世平 沈源明

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，患者呈年輕化趨勢[1-2]。手術結合術后輔助治療是EC最常見的治療方法。2013年美國癌癥基因組計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）提出EC分子分型計劃，將EC劃分為4類不同亞型：DNA聚合酶ε（DNA polymerase espilon，POLE）突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）型、低拷貝數(shù)（copy number abnormalities low，CNL）型和高拷貝數(shù)（copy number abnormalities high，CNH）型[3]。研究證實，TCGA分型比傳統(tǒng)的病理形態(tài)學分型能更準確地指導EC患者術后治療及預測預后。不同分子特征可能導致輔助放化療敏感性差異，根據(jù)TCGA分型特征給予個體化精準輔助治療是未來EC治療的發(fā)展趨勢。近年來，腫瘤免疫治療的快速發(fā)展打破了腫瘤的常規(guī)治療模式，尤其是免疫檢查點抑制劑在腫瘤治療中的應用[4]。程序性死亡蛋白1（programmed death protein-1，PD-1）/程序性死亡蛋白配體 1（programmed death protein-ligand 1，PD-L1） 在腫瘤組織及腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）中的表達是篩選免疫治療潛在獲益人群的一項指標。研究表明在POLE突變型、MSI型的EC中PD-1/PD-L多高表達，多對免疫檢查點抑制劑敏感,然而TCGA分型檢查過程繁瑣且價格昂貴，難以臨床推廣[5]。有學者提出一些簡化方法試圖替代TCGA分子分型，如根據(jù)免疫組化檢測錯位修復（mismatch repair，MMR）蛋白及抑癌基因p53表達情況將EC分為MMR缺失型/MMR完整型和p53突變型/p53野生型[6-8]。但對于這種簡化分型與傳統(tǒng)病理分型的相關性，以及其是否可輔助用于免疫檢查點抑制劑適用人群的篩選尚不清楚。本實驗通過免疫組化方法檢測MMR蛋白、p53及PD-L1在EC中的表達情況，并分析簡化的MMR/p53分子分型與EC的臨床病理特征以及PD-L1表達的相關性，以期為免疫檢查點抑制劑在EC中的應用提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年1月至2018年12月在湖州市婦幼保健院行子宮切除術的EC患者78例。所有患者均為初次治療、術前未接受過內(nèi)分泌治療且無其它腫瘤病史；術后常規(guī)病理切片均經(jīng)2位病理科醫(yī)師重新評估。患者年齡28～90歲，平均56.9歲，其中≤50歲22例，＞50歲56例。臨床分期采用2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）標準分期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別 59 例、8例、5例、6例。病理組織類型為子宮內(nèi)膜樣癌61例，非子宮內(nèi)膜樣癌 17例，包括漿液性癌10例，混合性癌2例，去分化癌2例，肉瘤、透明細胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌各1例；黏膜內(nèi)癌15例，肌層浸潤≤1/2者43例，肌層浸潤＞1/2者20例；脈管陽性22例，陰性 56例；57例行淋巴結切除，其中陽性9例，陰性48例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法 患者均采用免疫組化EnVision二步法檢測MMR蛋白、p53及PD-L1表達情況。MMR蛋白相關抗體包括鼠抗人MutL同源蛋白1（MutL homolog 1，MLH1）、MutS 同源蛋白 2（MutS homolog 2，MSH2）、MutS 同源蛋白 6（MutS homolog 6，MSH6）、減數(shù)分裂后分離蛋白 2（Postmeiotic segregation increased 2，PMS2）單克隆抗體及p53蛋白購自福建邁新公司，兔抗人PD-L1單克隆抗體（CAL10）購自美國Pathcom system公司。具體操作：石蠟切片62℃烤箱過夜，脫蠟和水化，使用 EDTA緩沖液高壓修復，室溫自然冷卻。3% H2O2溶液常溫避光孵育，PBS緩沖液沖洗后加一抗，室溫孵育60 min。PBS緩沖液沖洗3遍，加Max VisionTM2/HRP，室溫孵育后PBS緩沖液沖洗。DAB顯色，顯微鏡下觀察染色進展，染色成功后過水沖洗，蘇木素復染，流水返藍，乙醇脫水二甲苯透明，封片后鏡檢。

1.3 結果判讀 由2位病理科醫(yī)生進行雙盲獨立閱片。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 及 p53均定位于細胞核，內(nèi)對照為正常淋巴細胞或間質(zhì)細胞，4種MMR蛋白細胞核中均出現(xiàn)棕褐色著色即判定為MMR表達完整，如有一種及以上MMR蛋白未出現(xiàn)核著色則判定為MMR表達缺失。p53以細胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性表達。p53呈現(xiàn)彌漫陽性（＞70%）或完全陰性時，均判定為p53突變型，否則為p53野生型。PD-L1的陽性對照為扁桃體組織，定位于細胞膜，呈黃色或棕黃色染色。計數(shù)腫瘤細胞PD-L1陽性數(shù)，≥1%定義為陽性，＜1%為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以頻數(shù)和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用χ2分割法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MMR蛋白及p53在EC中的表達情況 MMR完整型60例，缺失型18例，缺失率為23.07%。其中單個蛋白PMS2缺失 9例，MSH6缺失2例，MSH2缺失1例，MLH1與PMS2共同缺失4例，MSH2與MSH6共同缺失2例。p53突變型21例，p53野生型57例，突變率為26.92%。

2.2 MMR蛋白及p53的表達與EC患者臨床病理特征的關系 MMR缺失型表達率與EC患者年齡、腫瘤病理類型、FIGO分期、肌層浸潤深度、脈管浸潤情況和淋巴結轉(zhuǎn)移均無關（均P＞0.05）。p53突變型表達率與EC患者年齡、腫瘤病理類型、FIGO分期、脈管浸潤情況和淋巴結轉(zhuǎn)移均有關（均P＜0.05），在＞50歲、非子宮內(nèi)膜樣癌、晚期內(nèi)膜癌（Ⅲ+Ⅳ）、脈管陽性、淋巴結轉(zhuǎn)移陽性患者中表達率升高，而與EC患者腫瘤肌層浸潤深度無關（P ＞0.05），見表1。

2.3 EC中PD-L1表達與MMR蛋白及p53表達的關系分析 PD-L1在p53突變型患者中的陽性表達率高于野生型患者（P＜0.05），而在MMR缺失型/完整型患者中陽性表達率比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表2。

表2 PD-L1表達與MMR及p53蛋白的關系[例（%）]

根據(jù)MMR蛋白及p53表達情況將78例EC患者分成4組：MMR缺失型且p53突變型組2例，MMR缺失組且p53野生型組16例，MMR完整型且p53突變型組19例，MMR完整型且p53野生型組41例。PD-L1在這4組患者中的陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。其中PD-L1在MMR缺失型且p53突變型組表達率最高，達100%，在MMR完整型且p53突變型組和MMR缺失組且p53野生型組中表達率相近，分別為73.68%和62.50%；在MMR完整型且p53野生型組表達率最低，為31.71%。其中，PD-L1在MMR完整型且p53突變型組與MMR完整型且p53野生型組表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 PD-L1在不同MMR/p53分子分型EC中的表達情況比較[例（%）]

3 討論

以往臨床對EC的分類大多為基于病理組織形態(tài)學，但這種方法主觀性強，可重復性差，對預后的評估及對臨床指導術后價值有限，不能滿足臨床需求。TCGA提出的EC的新的分子分類更能反應腫瘤的預后，更好地指導臨床，具有里程碑意義。但其推廣困難，研究者們致力于改良TCGA實驗方法，尋求簡便實用的分子分類方法。

MMR蛋白是MMR基因編碼的蛋白產(chǎn)物，在DNA復制過程中保證其高度保守性和遺傳的穩(wěn)定性。在EC的發(fā)病機制中，主要有4種MMR蛋白起關鍵作用，分別是 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，它們在人體內(nèi)以MLH1與PMS2結合，MSH2與MSH6結合形成二聚體復合物發(fā)揮作用。MMR蛋白表達缺失導致 DNA堿基錯配無法校正，引起具有微衛(wèi)星短串聯(lián)重復序列長度改變，導致MSI發(fā)生。免疫組化法和PCR法檢測MSI是目前相對簡便、快速、經(jīng)濟的方法，Stelloo等[9]應用2種方法對696例EC患者進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)兩者具有高度一致性。本研究中，MMR缺失型為23.07%（18/78），略低于TCGA分子分型中MSI高突變組（30%），其中以PMS2單個蛋白缺失最多見（11.54%），MLH1與PMS2配對缺失次之（5.13%）。18例MMR缺失型中，14例為中-高級別子宮內(nèi)膜樣癌，1例為漿液性癌，1例為混合型癌（漿液性癌+透明細胞癌），僅2例為低級別子宮內(nèi)膜樣癌。MMR蛋白缺失與EC患者的預后關系存在爭議，目前尚無統(tǒng)一定論。Pakish等[10]用免疫組化檢測了156例EC患者的MMR蛋白后發(fā)現(xiàn)，患者年齡、臨床分期、腫瘤組織學分類及病理學分級、肌層浸潤情況均與MMR蛋白是否缺失無關，這與本實驗結果一致。Nagle等[11]對澳大利亞728例EC患者生存分析結果顯示，EC的危險因素與MMR狀態(tài)無關。但國內(nèi)晉薇等[12]認為MMR蛋白表達缺失提示患者不良預后。他們研究顯示，MMR缺失型EC多為低分化、FIGO分期晚，伴有深肌層浸潤、脈管浸潤及淋巴結轉(zhuǎn)移者。也有學者認為MMR缺失型EC更易有磷酸酶張力蛋白同源酶（phosphatase and tensin homology，PTEN）突變，不伴有 p53 突變，惡性程度低，不易發(fā)生淋巴結浸潤和轉(zhuǎn)移[13]。Black等[14]發(fā)現(xiàn)，MMR缺失型EC患者的無病生存率和特異性生存率均有明顯改善。

MMR蛋白缺失型EC患者大多數(shù)是散發(fā)病例，僅有約3%患有遺傳性非息肉病性結直腸癌（Lynch綜合征）。Lynch綜合征是由MMR基因突變導致的常染色體顯性遺傳病，患者有高發(fā)EC、結腸癌、卵巢癌、胃癌等風險，而50%的女性患者中常以EC作為前哨癌。因此，對MMR缺失型患者及親屬進一步進行基因檢測及遺傳學咨詢意義重大。

p53突變發(fā)生在10%～20%的子宮內(nèi)膜樣癌和90%的漿液性癌[15]中，它是一種抑癌基因，能誘導細胞凋亡、抑制細胞生長、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。p53突變會喪失正常抑制癌細胞的作用，甚至能夠促進細胞惡性轉(zhuǎn)化。以往的研究提示p53突變是預后不良的因素，如Talhouk等[7]用p53免疫組化代替拷貝數(shù)檢測得到的p53突變型中，多為非子宮內(nèi)膜樣癌，且級別高、進展快、預后差。本研究結果也提示p53突變型中患者年齡大，多為疾病晚期，伴有淋巴結轉(zhuǎn)移，脈管浸潤，多為非子宮內(nèi)膜樣癌，該結果提示p53突變型可能是子宮內(nèi)膜癌預后不良的重要因素之一。

當前以PD-1/PD-L1為靶點的免疫治療已成為腫瘤強有力的新的治療方法，PD-L1表達于多種腫瘤組織中，其與配體PD-1結合后，抑制CD4+T細胞的增殖和活化，同時使IL-2和INF-α分泌下調(diào)，抑制T細胞功能，從而形成腫瘤免疫抑制的微環(huán)境，使得腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視。文獻報道MMR缺失型EC具有較高的突變率，腫瘤周圍具有豐富的淋巴細胞浸潤，患者是PD-1/PD-L1免疫治療的受益群體[3，16]。多個臨床研究表明，MMR缺失型患者的PD-L1蛋白表達率明顯升高，且經(jīng)免疫治療后，臨床緩解率明顯高于MMR完整型患者[17-19]。本研究顯示，PD-L1在EC中表達率為50%，在MMR缺失型中略高，表達率為66.7%，在p53突變型中最高，達76.2%。在結合MMR及p53蛋白分組中，PD-L1在這4組的表達有差異，主要在MMR完整型且p53突變型組與MMR完整型且p53野生型組之間，說明PD-L1的表達與p53突變或野生相關，與MMR蛋白表達完整或缺失不相關。這與上述文獻報道不符，可能與PD-L1克隆號不同有關，也可能與本研究樣本量較小有關。

本研究中有2例患者同時出現(xiàn)MMR缺失和p53突變，患者年齡均56歲，1例為漿液性癌，F(xiàn)IGOⅢ期，1例為混合性癌（漿液性癌+透明細胞癌），F(xiàn)IGO為Ⅳ期，均伴有附件浸潤和淋巴結轉(zhuǎn)移。Leon-Castillo等[20]分析了64例同時發(fā)生MMR缺失和p53突變的EC的臨床病理特征、分子表型及相關預后，他們認為這類EC的p53突變是腫瘤發(fā)展過程中的繼發(fā)性事件，他們建議應將這類EC歸入MMR缺失型EC。本研究中2例均為晚期患者，病程進展快，但PD-L1均陽性表達，提示PD-1/PD-L1免疫治療可能使之收益。

綜上所述，本研究結果顯示，p53蛋白對EC的預后及分型具有重要意義，MMR蛋白檢測為EC患者進行Lynch綜合征分流提供依據(jù)。PD-L1在MMR缺失且p53突變組表達，提示免疫治療可能使該分子亞型患者受益。EC是一組高度異質(zhì)性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展具有多種分子通路，本研究為回顧性分析，樣本量有限，對于EC的分子分型策略還需進一步深入的多中心臨床研究以獲得更多的實驗證據(jù)。