黃崇青 黃景勇 裘益輝

血管瘤是常見(jiàn)的腫瘤，好發(fā)于頭面部[1]。大多數(shù)皮下血管瘤是良性的，但有些可能轉(zhuǎn)化后變成惡性[2]。目前，血管瘤的增生和消退演變機(jī)制仍不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）A（VEGF-A）的表達(dá)在血管瘤的形成過(guò)程中起重要作用[3]。VEGF家族由6個(gè)成員組成：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placental growth factor，PLGF）[4]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，血管瘤增生期VEGF-A和VEGF-C的表達(dá)水平明顯高于血管瘤消退期；采用轉(zhuǎn)染攜帶短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）質(zhì)粒的方法抑制 VEGF-A或VEGF-C表達(dá)，可以抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（hemangioma endothelial cells，HemECs）的生長(zhǎng)；但 VEGF-A 和VEGFC似乎通過(guò)不同的信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)HemSCs的增殖和凋亡[5]。筆者團(tuán)隊(duì)在前期研究的基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步探討同時(shí)抑制VEGF-A和VEGF-C表達(dá)對(duì)HemECs增殖的影響及可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HemECs（上海生命科學(xué)研究所）；原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）（美國(guó) ATCC公司）；CAG 啟動(dòng)子（promoter of cytomegalovirus early enhancer element-chicken betaactin gene promoter-rabbit beta-globin gene acceptor，pCAG）-熒光素酶（luciferase，LUC）骨架（美國(guó) Clontech公司）；人胚胎腎細(xì)胞 293T（human embryonic kidney 293T，HEK293T）（美國(guó) ATCC 公司）；Lipofectamine-3000（美國(guó)Invitrogen公司）；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（美國(guó) Roche公司）；溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU）試劑盒（美國(guó)Millipore公司）；Western blot的初級(jí)抗體（美國(guó)Cell signaling公司），辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的抗兔二抗（美國(guó)Jackson Immuno研究所）；外購(gòu)的10周齡雄性裸鼠（上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），在每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下分析20只小鼠。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒑头纸M 將2×107個(gè)HemECs和1×107個(gè) HUVEC 混合，沉淀，然后重懸于 200 μl基質(zhì)膠（美國(guó) Becton-Dickinson Biosciences公司）皮下注射到裸鼠的背部。通過(guò)生物發(fā)光測(cè)定IVIS成像系統(tǒng)（美國(guó)Xenogen公司）對(duì)腫瘤進(jìn)行成像，4周后評(píng)估植入的腫瘤。在尾靜脈注射50 mg/kg體重的熒光素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）5 min后拍攝圖像，行腫瘤生物發(fā)光圖像采集（60 s后可得分析結(jié)果，行10次圖像分箱）。解剖裸鼠后測(cè)量植入腫瘤的重量。將實(shí)驗(yàn)裸鼠分為4組：空白對(duì)照組（control組）、通過(guò)shRNA技術(shù)抑制VEGF-A表達(dá)的shVEGF-A組、抑制VEGF-C表達(dá)的shVEGF-C組以及同時(shí)抑制VEGF-A和VEGF-C表達(dá)的shVEGFA+C組。

1.2.2 具體實(shí)驗(yàn)方案

1.2.2.1 質(zhì)粒制作 （1）以前面獲得的在消退期和增生期血管瘤中發(fā)生明顯表達(dá)水平變化的VEGF家族成員為對(duì)象，設(shè)計(jì)shRNA。（2）HemECs進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用攜帶對(duì)照（control組）或shVEGF-A或shVEGF-C或組合的 shVEGF-A和 shVEGF-C（shVEGF-A+C）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，采用RT-qPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上VEGF-A和VEGF-C mRNA的表達(dá)。（3）以確定抑制效率的攜帶特異shRNA的質(zhì)粒制作腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV），用以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。使用pCAG-LUC骨架制備pCAG-shVEGF-A-LUC、pCAG-shVEGF-C-LUC 和pCAG-shVEGF-A+C-LUC，進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證這些新制備的質(zhì)粒的正確方向。使用HEK293T細(xì)胞用Lipofectamine-3000產(chǎn)生攜帶目標(biāo)構(gòu)建體的AAV。shVEGF-A的序列是5'-TGTGAATGCAGACCAAAGA-3'。shVEGFC的序列是5'-TGCAAGCATTATGTCAGCA-3'。對(duì)照的序列是5'-GGTATCTACTAGATGTACT-3'。

1.2.2.2 抑制相應(yīng)VEGF蛋白對(duì)HemECs生長(zhǎng)和增殖的影響觀察 （1）以設(shè)計(jì)的攜帶特異的shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HemECs，并使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)的變化。具體為使用MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Roche公司）檢測(cè)570 nm處的吸光度值。（2）以設(shè)計(jì)的攜帶特異shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HemECs，并在細(xì)胞培養(yǎng)中加入BrdU，通過(guò)染色定量的方法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。具體為將BrdU（美國(guó) Sigma-Aldrich公司）加入到培養(yǎng)細(xì)胞中，終濃度為1 μg/ml；然后2 h后使用BrdU IHC試劑盒進(jìn)行BrdU的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DNA用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美國(guó) Thermo Scientific公司）染色。（3）以設(shè)計(jì)的攜帶特異shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HemECs，并提取細(xì)胞的蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)與細(xì)胞周期相關(guān)的因子變化以確定VEGF家族蛋白的下游的細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路。

1.2.2.3 抑制相應(yīng)VEGF蛋白對(duì)HemECs凋亡的影響觀察 （1）以設(shè)計(jì)的攜帶特異的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HemECs，并使用Annexin V方法，采用流式細(xì)胞分析技術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡的變化。（2）以設(shè)計(jì)的攜帶特異shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HemECs，并提取細(xì)胞的蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的因子變化以確定VEGF家族蛋白的下游的凋亡相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路。

1.2.2.4 抑制相應(yīng)VEGF蛋白對(duì)體內(nèi)血管瘤生長(zhǎng)的影響觀察 將抑制相應(yīng)VEGF蛋白的HemECs種植于裸鼠皮下，采用熒光素測(cè)定法（瘤細(xì)胞攜帶熒光素酶）測(cè)定其對(duì)體內(nèi)血管瘤生長(zhǎng)的影響，4周后解剖裸鼠后測(cè)量植入腫瘤的重量，觀察抑制相應(yīng)蛋白對(duì)體內(nèi)血管瘤生長(zhǎng)的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.14 組HemECs VEGF-A和VEGF-C mRNA表達(dá)水平比較 4組HemECs VEGF-A和VEGF-C mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與control組相比，shVEGF-A組HemECs VEGF-A mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05），shVEGF-C組HemECs VEGF-C mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05），shVEGF-A+C組VEGFA和VEGF-C mRNA表達(dá)均水平下降（均P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 4組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemECs）血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGF-A）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGF-C）mRNA表達(dá)水平比較（與 control組比較，*P＜0.05）

2.2 4組HemECs生長(zhǎng)情況比較 與control組比較，shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs均生長(zhǎng)受限（均P＜0.05）；而shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGFC組HemECs生長(zhǎng)受限更明顯（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 4組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemECs）生長(zhǎng)情況比較（與control組比較，*P＜0.05；與 shVEGF-A+C 組比較，△P＜0.05）

2.3 4組HemECs增殖情況和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子表達(dá)比較 與control組比較，shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs增殖均受抑制（均P＜0.05）；而shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs增殖受抑制更明顯（均P＜0.05）。與control組比較，shVEGF-A組細(xì)胞周期抑制因子p21表達(dá)水平升高（P＜0.05），細(xì)胞周期激活因子CyclinD1和CDK4表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；shVEGF-C組細(xì)胞周期抑制因子p27表達(dá)水平升高（P＜0.05），細(xì)胞周期激活因子CyclinB2表達(dá)水平降低（P＜0.05）；shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs細(xì)胞周期抑制因子p21、p27表達(dá)水平升高（均P＜0.05），細(xì)胞周期激活因子CyclinD1、CDK4表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。見(jiàn)圖3（插頁(yè)）。

圖3 4組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemECs）增殖情況和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子表達(dá)比較（a為HemECs BrdU檢測(cè)的代表性圖像，紅色為BrdU，藍(lán)色為DNA；b為BrdU細(xì)胞百分比比較；c為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子Western blot蛋白質(zhì)印跡；d為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子蛋白表達(dá)水平比較；與control組比較，*P＜0.05；與 shVEGF-A+C 組比較，△P＜0.05）

2.4 4組HemECs凋亡情況和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與control組相比，shVEGF-A組、shVEGF-C組HemECs中凋亡細(xì)胞百分比升高（均P＜0.05），而shVEGFA+C組比shVEGF-A組和shVEGF-C組HemECs中的細(xì)胞凋亡百分比更高（均P＜0.05）。與control組相比，shVEGF-A組HemECs促凋亡蛋白CYTC和caspase3表達(dá)水平均升高（均P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低（P＜0.05）；shVEGF-C組促凋亡蛋白 caspase9表達(dá)水平升高（P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低（P＜0.05）。shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGF-C組CYTC、caspase3和caspase9表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低。見(jiàn)圖4。

圖4 4組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemECs）凋亡情況和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（a為流式細(xì)胞圖比較；b為凋亡細(xì)胞百分比比較；c為凋亡相關(guān)蛋白Western blot蛋白質(zhì)印跡；d為凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較；與control組比較，*P＜0.05；與shVEGF-Atc組比較，△P＜0.05）

2.5 4組HemECs移植到裸鼠體內(nèi)后腫瘤生長(zhǎng)情況比較 與control組相比，shVEGF-A組和shVEGF-C組腫瘤均縮小，抑瘤率分別為25.35%、49.21%（均P＜0.05），而shVEGF-A+C組比shVEGF-A組和shVEGFC組腫瘤更小（均P＜0.05），抑瘤率為73.43%。見(jiàn)圖5（插頁(yè)）。

圖5 4組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（HemECs）移植到裸鼠體內(nèi)后腫瘤生長(zhǎng)情況比較（a為腫瘤生物發(fā)光測(cè)定代表性圖像；b為腫瘤發(fā)光圖像定量比較；c為腫瘤大小整體視圖比較；d為相關(guān)腫瘤重量比較；與control組比較，*P＜0.05；與shVE-A+C組比較，*P＜0.05）

3 討論

VEGF家族由6種分泌氨基酸組成，其中VEGF-A可能在血管生成中起著最重要的作用[6]。然而，VEGF-A的確切作用可能需與其他成員相協(xié)調(diào)，因?yàn)閂EGF成員和受體有一個(gè)復(fù)雜的配體-受體結(jié)合圖[7]。值得注意的是，VEGF-C只與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR）3 結(jié)合，通過(guò) VEGFR3促進(jìn)淋巴管生成，這與VEGF-A和VEGFR 2介導(dǎo)的血管生成不同[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF-A和VEGF-C的聯(lián)合抑制對(duì)HemECs的生長(zhǎng)有更顯著的限制作用，因此血管新生和淋巴管生成都是導(dǎo)致血管瘤惡性生長(zhǎng)的重要因素。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF-A或VEGF-C的抑制似乎通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響細(xì)胞增殖。例如，VEGF-A抑制細(xì)胞周期蛋白D1和CDK4表達(dá)，后者形成調(diào)控復(fù)合物來(lái)控制G1/S轉(zhuǎn)換[9]。VEGF-E抑制CyclinB2，CyclinB2主要控制G2/M轉(zhuǎn)變[10]。VEGF-A抑制不改變CyclinB2，VEGF-E抑制不改變CyclinD1和CDK4。此外，由于VEGF-A和VEGF-E的抑制作用分別增加了2個(gè)G1檢查點(diǎn)CDK抑制物p21和p27[11]，這些數(shù)據(jù)表明VEGF-A促進(jìn)HemECs的增殖可能主要通過(guò)促進(jìn)G1/S轉(zhuǎn)換，而VEGF-E可能通過(guò)促進(jìn)G1/S轉(zhuǎn)換和G2/M轉(zhuǎn)換促進(jìn)HemECs的增殖。因此可以理解，抑制VEGF-A和VEGF-E對(duì)HemECs有更顯著的抗增殖作用。

同樣，本研究結(jié)果顯示VEGF-A或VEGF-C的抑制作用可能通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響細(xì)胞凋亡。CYTC通過(guò)Apaf1和pro-caspase9產(chǎn)生凋亡體，將procaspase9切割成活性二聚體caspase9，介導(dǎo)caspase3的切割[12]。顯然，VEGF-A和VEGF-C信號(hào)傳導(dǎo)控制著細(xì)胞凋亡的不同階段。因此，同時(shí)抑制VEGF-A和VEGFC對(duì)HemECs有更顯著的促凋亡作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，VEGF-A和VEGF-C通過(guò)信號(hào)通路中的不同蛋白調(diào)節(jié)HemECs的增殖和凋亡。VEGF-A和VEGF-C雙拮抗在體內(nèi)外對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用更為明顯。