管陳安 葉華茂 徐光標(biāo) 王莎莎 蔣鉆紅

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）屬糖尿病并發(fā)癥之一，也是造成國人終末期腎病第2位的原因；機(jī)體持續(xù)的高糖狀態(tài)是DN形成的主要原因[1]。高糖環(huán)境下足細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），即腎小球臟層上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化；足細(xì)胞EMT是DN尿蛋白形成和腎臟纖維化形成的重要機(jī)制之一[2]。熟地黃具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓功效。熟地黃提取物（rehmannia glutinosa extract，RGE）作為熟地黃主要成分，表現(xiàn)出明顯護(hù)肝活性，但其藥理學(xué)機(jī)制尚不清楚[3]，其是否對DN有影響也尚未明確。在糖尿病并發(fā)癥中，蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱 AKT）/糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）信號通路與DN、糖尿病心肌病等關(guān)系密切[4]?；诖?，本研究采用高糖高脂、鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)建立DN大鼠模型，探討RGE對DN大鼠EMT的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠（SPF級），體重（200±10）g，8～10周齡，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2018-0013；動(dòng)物使用許可證號：SYXK（京）2018-0051；動(dòng)物質(zhì)量合格證號：WTLH2020041517]。所有大鼠均在溫度（24±0.5）℃、濕度（55±5）%、光照/黑暗（12/12）h環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 主要藥物、試劑與儀器 熟地黃（西安嘉博盈生物科技有限公司，批號：121196，純度：96%，經(jīng)鑒定符合2015年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定[5]）；高糖高脂飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司，批號：TP-2002，各組分比例：基礎(chǔ)飼料61.9%、蔗糖20%、豬油10%、蛋黃粉8%、膽酸鈉0.1%）；STZ（美國sigma公司，批號：S0131）；鹽酸貝那普利片（北京諾華制藥有限公司，10 mg/片，批號：20191013）；尿蛋白定量測試盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號：SNM297）；HE試劑盒（上海生工生物技術(shù)公司，批號：E607318）；糖原染色（periodic acid-schiff stain，PAS）、馬森三色染色（Masson's trichrome stain，MASSON）試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司，批號分別為：G1280、G1340）；RNA 提取試劑盒、cDNA 第一條鏈合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、蛋白裂解液（北京啟維益成科技有限公司，批號分別為：114162-64、25011、R121-1、L1667）；磷酸化 AKT（p-AKT）、AKT、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、GSK-3β、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、羊抗鼠二抗（英國abcam公司，批號分別為 ：ab8805、ab151279、ab145937、ab93926、ab9485、ab1003）。血糖儀（德國羅氏集團(tuán)，型號：Accu-Chek Active）；分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司，型號：UNICOWFJ2）；顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司，型號：XPF-500C）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀（美國ABI公司，型號：7500）；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天根科技有限公司，型號：Tanon 4800）。

1.2 方法

1.2.1 RGE的制備 熟地黃依次經(jīng)過石油醚、乙醚去脂溶性雜質(zhì)，80%乙醇脫單糖、低聚糖，1 kg加10 L水，在90～100℃水中提取3次，3 h/次，提取液合并并過濾，70℃水浴減壓濃縮，加入5倍95%乙醇沉淀過夜；沉淀物經(jīng)無水乙醇、丙酮、乙醚沉淀，經(jīng)65℃真空干燥得地黃多糖，純度鑒定為良好，放置備用。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥處理 實(shí)驗(yàn)前所有大鼠檢測尿蛋白、血糖水平，沒有出現(xiàn)異常。參照文獻(xiàn)[6]構(gòu)建DN大鼠模型，高糖高脂飼料飼養(yǎng)大鼠4周，4周后禁食12 h腹腔注射40 mg/kg STZ，72 h后尾靜脈采血檢測血糖水平，空腹血糖≥16.70 mmol/L即為造模成功。建模成功60只，隨機(jī)分為模型組、RGE（低、中、高）劑量組、陽性對照組，每組12只；另擇12只大鼠作為對照組，對照組基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)4周，4周后禁食12 h腹腔注射等體積0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液。RGE（低、中、高）劑量組（1、2、4）g/kg RGE灌胃[7]，陽性對照組 4 mg/kg貝那普利灌胃[8]，對照組、模型組0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃液體體積均為10 ml/kg，1次/d，連續(xù)6周。

1.2.3 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察大鼠一般情況，包括大鼠毛色情況、精神狀態(tài)、飲食狀態(tài)、大小便情況等。

1.2.4 血糖、尿蛋白、腎功能指標(biāo)檢測 收集大鼠24 h尿液，尾靜脈采血，立即處死大鼠，部分腎臟置于4%多聚甲醛中固定，部分置于-80℃冰箱保存待檢。采用血糖儀檢測血糖水平，采用尿蛋白定量測試盒定量分析24 h尿蛋白，分光光度計(jì)檢測尿肌酐、血清肌酐、血清尿素氮水平。

1.2.5 腎臟組織形態(tài)觀察 4%多聚甲醛中固定的腎臟組織經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后切片，切片厚度6 μm，每組取部分切片，經(jīng)HE、PAS、MASSON染色后顯微鏡下觀察腎臟組織形態(tài)。

1.2.6 腎臟組織 E-鈣黏素（E-cadherin，E-Cad）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）mRNA表達(dá)檢測 采用qRTPCR法。-80℃冰箱中取部分腎臟組織，RNA提取試劑盒提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，引物序列如下，E-Cad（289bp）F：5'-TTCAAGGTCAGCCTGGTATA-3'、R：5'-AAAGGGCACGCTATCAACAT-3'；α-SMA（403bp）F：5'-ACTGGTATTGTGCTGGACTC-3'、R：5'-TGATGCTGTTATAGGTGGTT-3'；FN（375bp）F：5'-CAACCAGCAGAGTCCCAAAG-3'、R：5'-TCCCAGGAGACGGTAAGCAC-3'；GAPDH（196bp） F：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC-3'、R：5'-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'。20 μl反應(yīng)體系：10 μl 2×SYBR qPCR Mix、1 μl cDNA （50 ng/μl）、0.5 μl/0.5 μl F/R（10 μmol/L）、8 μl ddH2O；反應(yīng)條件包括 94 ℃、60 s；95 ℃、30 s，（56.9 ℃、30 s，57.4 ℃、40 s，56.5 ℃、40 s，58.0 ℃、30 s），40個(gè)循環(huán)。引物由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。2-ΔΔCt法計(jì)算 E-Cad、α-SMA、FN mRNA 相對表達(dá)水平。

1.2.7 腎臟組織 p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。部分腎臟組織添加蛋白裂解液冰上研磨，13 400 r/min（離心半徑10 cm）4℃離心20 min后收集上清液，即為總蛋白。凝膠電泳分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分 別 加 入 一 抗 p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、GAPDH，4℃孵育過夜；加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)對結(jié)果拍照并用自帶軟件進(jìn)行灰度值分析。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠一般情況比較 對照組大鼠毛色發(fā)亮、精神活躍，飲食、大小便均正常；模型組大鼠毛色灰暗、精神萎靡，尿液量明顯增多且發(fā)臭；RGE（低、中、高）劑量組、陽性對照組毛色較模型組有明顯緩和、精神狀態(tài)緩解，尿液量相對減少。

2.2 6組大鼠血糖、尿蛋白、腎功能指標(biāo)比較 與對照組相比，模型組大鼠血糖、24 h尿蛋白、尿肌酐、血清肌酐、血清尿素氮水平均升高（均P＜0.05）；與模型組相比，RGE低劑量組大鼠血糖、24 h尿蛋白、血清肌酐、血清尿素氮水平均降低（均 P＜0.05），RGE（中、高）劑量組、陽性對照組大鼠血糖、24 h尿蛋白、尿肌酐、血清肌酐、血清尿素氮水平均降低（均P＜0.05）。見表1。

表1 6組大鼠血糖、尿蛋白、腎功能指標(biāo)比較

2.3 6組大鼠腎臟組織形態(tài)比較 對照組大鼠腎小管、腎小球排列正常、細(xì)胞分布均勻；模型組腎臟組織腎小管空泡變性，腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張，腎小球硬化和膠原沉積現(xiàn)象明顯；RGE（低、中、高）劑量組、陽性對照組病理變化明顯減輕。見圖1（插頁）。

圖1 6組大鼠腎臟組織病理學(xué)圖片（REG為熟地黃提取物；PAS為糖原染色；MASSON為馬森三色染色；×400）

2.4 6組大鼠腎臟組織E-Cad、α-SMA、FN mRNA表達(dá)水平比較 與對照組相比，模型組大鼠腎臟組織E-CadmRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05），α-SMA、FN mRNA 表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）；與模型組相比，RGE（低、中、高）劑量組、陽性對照組腎臟組織α-SMA、FN mRNA 表達(dá)水平降低（均 P＜0.05），RGE（中、高）劑量組、陽性對照組腎臟組織E-Cad mRNA水平均升高（均P＜0.05）。見表2。

表2 6組腎臟組織中E-Cad、α-SMA、FN mRNA水平比較

2.5 6 組大鼠腎臟組織 p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表達(dá)水平比較 6組大鼠腎臟組織AKT、GSK-3β蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與對照組相比，模型組大鼠腎臟組織p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β 蛋白表達(dá)水平升高（均 P＜0.05）；與模型組相比，RGE（低、中、高）劑量組、陽性對照組腎臟組織p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達(dá)水平均降低（均 P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 6 組大鼠腎臟組織 p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β 蛋白表達(dá)電泳圖比較[p-AKT為磷酸化AKT；AKT為蛋白激酶B；p-GSK-3β為磷酸化GSK-3β；GSK-3β為糖原合成酶激酶-3β；GAPDH為3-磷酸甘油醛脫氫酶；A為對照組，B為模型組，C為熟地黃提取物（RGE）低劑量組，D為RGE中劑量組，E為RGE高劑量組，F(xiàn)為陽性對照組]

表3 6組大鼠腎臟組織p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)將糖尿病稱為消渴病，DN屬其并發(fā)癥，中醫(yī)上并無DN的獨(dú)立記載，但卻發(fā)現(xiàn)消渴日久可出現(xiàn)水腫，巢元方《諸病源候論》：“消渴其久病變，或發(fā)癰疽，或成水疾”。宋·趙佶《圣濟(jì)總錄》提出“消腎”之病名，云：“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開闔不利，能為水腫”[9]。上述描述與DN癥狀類似，DN的基本癥候的治療原則為內(nèi)熱燔灼、消蝕氣陰，可苦寒堅(jiān)陰、清熱益氣；經(jīng)絡(luò)榮衛(wèi)氣傷、內(nèi)有干血，當(dāng)化瘀通絡(luò)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠毛色灰暗、精神萎靡，尿液量明顯增多且發(fā)臭，腎臟組織發(fā)現(xiàn)腎小管空泡變性，腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張，腎小球硬化和膠原沉積現(xiàn)象明顯，提示DN大鼠出現(xiàn)明顯腎臟組織病理損傷，導(dǎo)致腎小球、腎小管功能障礙，進(jìn)而腎小球重吸收功能發(fā)生障礙，影響疾病。與模型組相比，RGE（低、中、高）劑量組出現(xiàn)明顯的癥狀緩解情況，《本經(jīng)逢原》有云：“熟地黃，假火力蒸曬，轉(zhuǎn)苦為甘，為陰中之陽，故能補(bǔ)腎中元?dú)狻盵10]。RGE作為熟地黃主要活性成分在其中發(fā)揮作用，且在DN中不同劑量RGE均表現(xiàn)出對疾病的緩解作用。研究還顯示，與對照組相比，模型組血糖、24 h尿蛋白、尿肌酐、血清肌酐、血清尿素氮水平升高，提示模型組大鼠腎功能損傷嚴(yán)重；而與模型組相比，RGE（低、中、高）劑量組及陽性對照組上述水平均有所降低，表明RGE及陽性藥物組均可明顯緩解大鼠腎功能損傷，具有保護(hù)腎功能作用。

腎纖維化過程中表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)過度合成、重塑、沉淀，中心環(huán)節(jié)涉及EMT過程，病理狀態(tài)下可觀察到上皮細(xì)胞表現(xiàn)出纖維化現(xiàn)象[11]。在EMT中上皮標(biāo)志物E-Cad表達(dá)缺失，間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、FN過表達(dá)為主要特征[12]，其中E-Cad存在于正常上皮細(xì)胞連接處，是細(xì)胞與細(xì)胞間連接的關(guān)鍵黏附分子，缺失E-Cad會(huì)導(dǎo)致與之結(jié)合的核內(nèi)堆積蛋白游離出來，進(jìn)而激活一系列間質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄[13]，如間質(zhì)基因α-SMA的表達(dá)和肌動(dòng)蛋白重組過程，進(jìn)而導(dǎo)致間質(zhì)升高；FN作為目前公認(rèn)的基質(zhì)成分之一，其水平反映基質(zhì)情況[14-15]。大量成纖維細(xì)胞在腎小管處通過EMT過程分泌細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)腎臟纖維化過程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組腎臟組織中E-Cad mRNA表達(dá)水平降低，α-SMA、FN mRNA表達(dá)水平升高，提示DN腎臟組織中關(guān)鍵黏附分子E-Cad使與其結(jié)合的核內(nèi)堆積蛋白游離出來，進(jìn)而激活間質(zhì)基因α-SMA的表達(dá)，從而促進(jìn)FN分泌，增加基質(zhì)水平，可能促進(jìn)纖維化水平，加重疾病。與模型組相比，RGE（低、中、高）劑量組、陽性對照組腎臟組織中α-SMA、FN mRNA 水平降低，RGE（中、高）劑量組、陽性對照組腎臟組織中E-Cad mRNA水平升高，提示RGE恢復(fù)緩解E-Cad水平，使其作用正常，減少α-SMA、FN的表達(dá)，從而緩解足細(xì)胞EMT過程，緩解疾病。

AKT作為PI3K/AKT信號通路重要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可參與細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)合成、葡萄糖運(yùn)輸、血管生成等其他重要的生理功能調(diào)節(jié)[17]，在EMT中誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生改變[18]，GSK-3β是AKT的下游基因，參與AKT信號通路EMT過程，靜息狀態(tài)下呈去磷酸化狀態(tài)，受到刺激后通過影響Snail基因等下游底物發(fā)揮作用[19-20]，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)p-GSK-3β與E-Cad存在明顯相關(guān)性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組腎臟組織中p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β 蛋白水平升高，提示在DN中刺激AKT磷酸化從而激活下游GSK-3β表達(dá)，且與E-Cad關(guān)系密切，可能影響E-Cad發(fā)揮作用。與模型組相比，RGE（低、中、高）劑量組、陽性對照組腎臟組織中p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白水平降低，提示RGE干擾DN后AKT激活狀態(tài)被抑制，從而緩解對GSK-3β的影響，進(jìn)而恢復(fù)E-Cad水平，減少α-SMA、FN的表達(dá)，緩解EMT過程，緩解DN纖維化過程。

綜上所述，RGE可抑制AKT/GSK-3β信號通路活化以及緩解足細(xì)胞EMT過程，從而實(shí)現(xiàn)對DN大鼠的保護(hù)。但RGE成分復(fù)雜，亦可能通過其他途徑發(fā)揮作用，亦可能RGE影響AKT上游基因發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步研究。