顧雪林，田丹陽(yáng)，魏 賓，周曉東，鈕 靜，張茂友，宋學(xué)宏

(1.蘇州市吳中區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州大學(xué)，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 蘇州 215006)

青蝦因生長(zhǎng)快、病害少、養(yǎng)殖成本低、經(jīng)濟(jì)效益穩(wěn)定而受廣大養(yǎng)殖戶的喜愛(ài)，成為江蘇省主推的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，其養(yǎng)殖面積及產(chǎn)量穩(wěn)中有升。但近年來(lái)養(yǎng)殖者反映青蝦也出現(xiàn)散發(fā)性死亡，附肢與身體發(fā)紅，有時(shí)死亡率達(dá)30%～40%。青蝦紅肢病也稱紅體病、紅頭病、紅體綜合征，4－11 月是該病的流行季節(jié)，發(fā)病高峰為6－9 月，發(fā)病率為40%～60%，死亡率為15%～40%。2020 年8 月蘇州市吳中區(qū)稻蝦綜合種養(yǎng)基地發(fā)生了紅肢病，青蝦出現(xiàn)零星死亡。抽樣檢查發(fā)現(xiàn)，附近70%的池塘發(fā)病，發(fā)病池中有10%～30%的青蝦身體顏色變深，有的蝦游泳足變?yōu)榧t色、腹部和尾扇微紅、鰓部顏色變淺、肝區(qū)形狀模糊、腸道無(wú)食、活力差，死亡率為10%～15%。本文對(duì)該蝦病的病原進(jìn)行了分離鑒定并開(kāi)展了藥敏試驗(yàn)，以期為生產(chǎn)上有效防控該病提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與分析

1.試驗(yàn)用青蝦來(lái)源 病蝦與健康試驗(yàn)蝦分別來(lái)自蘇州市吳中區(qū)稻蝦綜合種養(yǎng)基地的發(fā)病田與另一個(gè)未發(fā)病養(yǎng)殖戶的青蝦池塘。病蝦規(guī)格為(2.32±0.74)克，健康蝦規(guī)格為(2.13±1.03)克。

2.病原菌分離與純化 取具典型紅肢癥狀的患病青蝦浸泡于75%的酒精中1 分鐘，用無(wú)菌鑷子打開(kāi)病蝦頭部，取出肝胰腺至1 毫升LB 液體培養(yǎng)基中，連續(xù)吹打5次后100倍稀釋，取50微升稀釋液涂布平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。再將分離到的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，用pH 7.2 的PBS 洗滌菌苔并稀釋至2×104CFU/毫升，4℃保存用于后續(xù)的攻毒試驗(yàn)與分類鑒定。

3.病原菌的攻毒試驗(yàn) 將購(gòu)回的健康蝦放在圓形養(yǎng)殖桶(直徑30 厘米、高40 厘米)曝氣暫養(yǎng)1周后，取無(wú)病活潑的健康蝦隨機(jī)分入養(yǎng)殖桶，每桶6只，進(jìn)行感染攻毒試驗(yàn)。在試驗(yàn)蝦的第3肌節(jié)注射待檢菌液20 微升/只，即4×102CFU/尾，對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水，劑量同試驗(yàn)組。每組設(shè)3個(gè)平行，飼養(yǎng)水溫26℃，pH 7.8，觀察青蝦的發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)。

4.病原菌的分類鑒定 將分離純化的細(xì)菌28℃培養(yǎng)24 小時(shí)后進(jìn)行革蘭氏染色和形態(tài)觀察，純培養(yǎng)物采用BBL Crystal微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行初步分類鑒定。然后委托金唯智生物科技有限公司進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA 測(cè)序，測(cè)序拼接的16S rDNA 基因序列的可變區(qū)V3～V4 片段經(jīng)NCBI GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)、構(gòu)建分枝系統(tǒng)樹(shù)，確認(rèn)所分離細(xì)菌的分類地位。

5.藥物敏感試驗(yàn) 采用動(dòng)物用藥敏分析試劑板(南京菲恩醫(yī)療科技有限公司)對(duì)分離的細(xì)菌純培養(yǎng)物進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。檢測(cè)細(xì)菌對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟甲喹、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲唑＋甲氧芐啶等8種藥物的敏感性。

6.發(fā)病蝦的藥物治療 在病原體檢驗(yàn)與藥敏試驗(yàn)的同時(shí)對(duì)青蝦進(jìn)行了治療，采用拌料口服鹽酸多西環(huán)素1 克/千克飼料，連續(xù)5 天，全池潑灑苯扎溴銨1.5 克/米3兩次，隔天1 次，同時(shí)潑灑1.5克/米3的過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物進(jìn)行改底。

二、結(jié)果與分析

1.病原菌的致病力 檢查發(fā)現(xiàn)，病蝦的游泳足變?yōu)榧t色、腹部和尾扇微紅、鰓部顏色變淺、肝區(qū)形狀模糊、腸道無(wú)食、活力差，病蝦癥狀見(jiàn)圖1A。從病蝦肝胰腺中分離到兩種菌，分別記作qx8151 和 qx8152，在水溫 26℃、pH 7.8 的水環(huán)境條件下，將兩株純培養(yǎng)物分別以4×102CFU/尾的劑量攻毒后，qx8151 菌組在24 小時(shí)游泳足、腹部和尾扇呈紅色，以及鰓部顏色變淺的典型癥狀，50% 以 上 死 亡 ， 至 48 小 時(shí) 死 亡 率 為 100% ；qx8152 菌感染后蝦體色略顯深灰色，在24 小時(shí)也出現(xiàn)少量死亡，死亡率為16.7%，到48小時(shí)死亡率為16.7%～33.3%，感染后發(fā)病癥狀見(jiàn)圖1B～圖1E。T 檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白組與生理鹽水組無(wú)差異；qx8152 菌株組與生理鹽水組也無(wú)顯著差異，與空白組有差異(P＜0.05)，與qx8151菌組差異極顯著(P＜0.01)；qx8151 菌組與所有組的差異均極顯著(P＜0.01)(表1)。上述結(jié)果說(shuō)明，qx8151 菌株的致病性非常強(qiáng)，qx8152 菌株的致病性遠(yuǎn)小于qx8151菌株，qx8152菌應(yīng)為條件致病菌。

圖1 發(fā)病的蝦與致病菌感染后蝦的發(fā)病癥狀

2.病原菌分類鑒定 從病蝦肝胰腺中分離出的兩種菌落qx8151 和qx8152，其中qx8151 的菌落小、圓形、邊緣光整，培養(yǎng)24小時(shí)后的直徑達(dá)1.0毫米左右，菌落呈乳白色半透明；菌落數(shù)占所有菌落的90%以上，細(xì)菌革蘭氏染色陰性，彎桿狀。qx8152 的菌落較qx8151 大、圓形、微凸、邊緣整齊、表面光滑，培養(yǎng)24 小時(shí)后菌落直徑達(dá)1.5～2.0 毫米，淺黃色半透明，菌落數(shù)占10%左右，革蘭氏染色陰性，形狀短桿狀。

兩株菌的純培養(yǎng)物經(jīng)BBL Crystal 微生物鑒定系統(tǒng)初步分類鑒定，結(jié)果顯示菌株qx8151 與擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)的相似度最高，可信度值為97.01%；菌株qx8152 與嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的相似度最高，可信度值為99.83%。兩株純培養(yǎng)物分離測(cè)序的16S rRNA基因通過(guò)Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì)的結(jié)果顯示，菌株qx8151 與擬態(tài)弧菌及霍亂弧菌的同源性最高，與擬態(tài)弧菌聚為1支；菌株qx8152與嗜水氣單胞菌的同源性最高。綜上所述，菌株qx8151 為擬態(tài)弧菌，菌株qx8152為嗜水氣單胞菌。

3.藥物敏感性與治療效果 藥敏試驗(yàn)檢測(cè)擬態(tài)弧菌與嗜水氣單胞菌對(duì)8種抗生素的敏感性，結(jié)果如表2～表4 所示，擬態(tài)弧菌對(duì)恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹的敏感性較強(qiáng)，0.10微克/毫升就能抑制擬態(tài)弧菌；磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲唑＋甲氧芐啶基本無(wú)效。嗜水氣單胞菌對(duì)這8 種抗生素的敏感性明顯小于擬態(tài)弧菌，只有0.78微克/毫升濃度的恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素能抑制嗜水氣單胞菌，其他抗生素基本無(wú)效，可能嗜水氣單胞菌對(duì)這些抗生素產(chǎn)生了抗性。

采取連續(xù)拌料口服鹽酸多西環(huán)素藥餌5天，全池潑灑苯扎溴銨、過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物改底等治療方案對(duì)發(fā)病池塘的青蝦進(jìn)行了治療，結(jié)果在第3天青蝦就從每畝死亡幾百尾下降至10 多尾，第4 天停止死亡，取得了預(yù)期的治療效果。

表1 病蝦分離菌的純培養(yǎng)物致病率

表2 擬態(tài)弧菌與嗜水氣單胞菌的藥物敏感性

表3 菌株對(duì)磺胺間甲氧嘧啶鈉藥物敏感性

表4 菌株對(duì)磺胺甲唑＋甲氧芐啶的藥物敏感性

表4 菌株對(duì)磺胺甲唑＋甲氧芐啶的藥物敏感性

擬態(tài)弧菌 嗜水氣單胞菌藥物濃度(微克/毫升)16/3.2＋8/1.6＋4/0.8＋2/0.4＋1/0.2＋藥物濃度(微克/毫升)16/3.2＋8/1.6＋4/0.8＋2/0.4＋1/0.2＋

三、結(jié)論

1.病原菌的致病性較強(qiáng) 青蝦紅肢病或紅體病是近年來(lái)青蝦養(yǎng)殖中常發(fā)的疾病，發(fā)病季節(jié)是5－10 月，本次分離到的qx8151 菌株為擬態(tài)弧菌，菌落特征與生化檢定結(jié)果與葉雪平等(2002)描述的一致，4×102CFU/尾的接種量在48 小時(shí)青蝦全部死亡，其致死濃度遠(yuǎn)低于青蝦980910株(葉雪平等分離)的攻毒濃度(5×104CFU/尾)，毒力較強(qiáng)。qx8152 菌株為嗜水氣單胞菌，用4×102CFU/尾的攻毒量，青蝦48小時(shí)的平均死亡率為27.3%，致病力相對(duì)較弱。

2.治療方案 藥敏試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，目前稻蝦田塊和池塘中的強(qiáng)毒株擬態(tài)弧菌對(duì)恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹敏感，弱毒株嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素較敏感。根據(jù)體內(nèi)外同時(shí)進(jìn)行治療策略以及治療初步效果，建議用以下方法進(jìn)行綜合治療，即采用拌料口服鹽酸多西環(huán)素1 克/千克飼料，連續(xù)5 天，全池潑灑苯扎溴銨1.5 克/米3兩次，隔天1 次，同時(shí)潑灑1.5克/米3的過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物進(jìn)行改底。