劉 蕓,趙 旭,胡小英,付建平,張素坤,任明忠

生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所,國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境污染健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510655

高分辨率氣相色譜-高分辨率質(zhì)譜法(HRGCHRMS 法)被譽(yù)為開展環(huán)境二英類污染物檢測的“金方法”,具有高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點(diǎn),但其成本高昂,難以開展高頻次、大范圍的推廣應(yīng)用,影響到了二英分析測試的常態(tài)化[6]。 生物檢測方法具有操作便捷、費(fèi)用低廉,且能通過各種代謝活化酶類的作用模擬人體真實(shí)情況等優(yōu)點(diǎn),受到了越來越多的關(guān)注[7-9]。 常見的生物檢測方法有酶活力誘導(dǎo)法(7-乙氧基-3-異吩惡唑酮-脫乙基酶 法, EROD 法)[10]、 熒 光 素 酶 報(bào) 告 基 因法[5,11-13]、酶免疫分析法[14-15]和熒光免疫分析法[16]等。 美國食品與藥品管理局(FDA)利用EROD 法進(jìn)行食品中二英的檢測[17];日本環(huán)境省把基于芳香烴受體(AhR)的二英生物報(bào)告基因監(jiān)測方法和使用二英作抗原的抗原體反應(yīng)方法設(shè)定為廢物焚燒爐所排放二英的檢測方法[17];我國也已開展了大量關(guān)于二英類污染物生物檢測方法的研究[7,11,18-20]。

針對上述問題,本研究開展了以下工作:一是優(yōu)化前處理方法,對傳統(tǒng)EROD 法的樣品前處理過程進(jìn)行改進(jìn),提高回收率的同時(shí),盡可能多地去除環(huán)境樣品中可能存在的干擾物,即非二英類AhR 誘導(dǎo)活性物質(zhì),降低干擾物質(zhì)的影響;二是利用同一環(huán)境樣品、相同前處理過程,計(jì)算生物檢測法與儀器分析法測定結(jié)果的一致性,了解生物實(shí)驗(yàn)材料自身與環(huán)境樣品中的二英類污染物反應(yīng)的有效性;三是開展應(yīng)用實(shí)例,采集不同地區(qū)垃圾焚燒廠飛灰樣品,采用改進(jìn)后的生物方法進(jìn)行檢測,評估將生物檢測法作為儀器分析法的替代方法進(jìn)行推廣的可行性,為加強(qiáng)環(huán)境中二英類污染物的監(jiān)測與監(jiān)管提供數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器:氮吹儀(上海秉越,BYN100),二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo,6500),生物安全柜(新加坡ESCO,AC2-S),高分辨氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent,7890A-5975C),全波段酶標(biāo)儀(美國Biotek,Synergy HT),臺式高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo,Biofuge Primo R),電子天平(德國Sartorius,BS224S)。

實(shí)驗(yàn)試劑和材料:大鼠肝細(xì)胞瘤H4-ⅡE 細(xì)胞系(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心),DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、胰酶、7-乙氧基-異吩惡唑酮(ERF)、2,3,7,8-四氯代二苯-并-對二英(2,3,7,8-TCDD)、試鹵靈(RF)(美國Sigma),異丙醇、DMSO、正己烷(北京化學(xué)試劑公司,分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集和預(yù)處理

飛灰樣品的采集和儲藏參考《工業(yè)固體廢物采樣制樣技術(shù)規(guī)范》(HJ/T 20—1998)和《海洋監(jiān)測規(guī)范 第3 部分:樣品采集、貯存與運(yùn)輸》(GB 17378.3—2007)。 用干凈的不銹鋼采集裝置采集一定量的飛灰樣品,隨后用錫箔紙包好放入密封袋中,低溫環(huán)境下送回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干、破碎、過篩,然后進(jìn)行樣品前處理。

實(shí)驗(yàn)樣品為我國南部地區(qū)3 家垃圾焚燒廠的飛灰,編號分別為KW2、KW4 和FH2。 取40 g 飛灰樣品,鹽酸(2 mol/L)浸泡0.5 h,濾紙濾干,用大量去離子水沖洗,濾干并冷凍干燥后,采用甲苯索氏抽提法對樣品抽提48 h。

1.2.2 EROD 法檢測

1.2.2.1 樣品凈化

將抽提濃縮后的樣品依次通過:多段硅膠柱,用正己烷進(jìn)行洗脫;氧化鋁-弗羅里硅土復(fù)合柱,用正己烷-二氯甲烷(體積比95 ∶5)洗脫;凝膠滲透色譜柱,用正己烷-二氯甲烷(體積比1 ∶1)洗脫。 收集洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)溶

1.2.2.3 檢測

將生長良好的大鼠肝細(xì)胞瘤H4-ⅡE 細(xì)胞按每孔2×105個(gè)接種到96 孔板中,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,棄去培養(yǎng)液。 取無菌潔凈EP 管,先加入995 μL DMEM(添加胎牛血清與雙抗)培養(yǎng)液,再加入5 μL 前處理后的待測樣品,渦旋混勻,按照每孔100 μL 添加于96 孔板中。 每個(gè)培養(yǎng)板中添加 DMSO 溶劑對照及2,3,7,8-TCDD 陽性對照,每個(gè)待測樣品和對照均設(shè)置4 個(gè)平行孔。 72 h 后取出96 孔板,棄去溶液,加入100 μL 新鮮配制的含1 μL 1 mmol/L ERF 和0.1 μL 10 mmol/L 雙香豆素的DMEM 培養(yǎng)液,于CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)60 min 后,加入130 μL 甲醇終止反應(yīng),室溫下混勻。 取100 μL 混合液于酶標(biāo)板中,用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)終產(chǎn)物RF 的熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長設(shè)為535 nm,吸收波長設(shè)為590 nm。 將96孔板中剩余的反應(yīng)液吸出,加入NaOH 溶液破碎細(xì)胞。 細(xì)胞破碎后,吸出100 μL 棄掉,再加入200 μL考馬斯亮藍(lán)(G250)染液,反應(yīng)10 min,用酶標(biāo)儀在595 nm 吸收波長處測定蛋白吸光值。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1)RF 標(biāo)準(zhǔn)曲線。 配制一組濃度范圍為0 ～200 nmol/L 的RF 溶液,在535 nm 激發(fā)波長和590 nm 吸收波長下,用酶標(biāo)儀測定其熒光值,建立熒光值與濃度之間的線性關(guān)系,從而將測得的熒光值轉(zhuǎn)換成RF 的量(nmol/L)。

2)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。 配制一組濃度范圍為0 ～500 mg/mL 的牛血清白蛋白溶液,加入G250 染液200 μL,反應(yīng)10 min 后,在595 nm 波長處測定吸光度,建立吸光度與蛋白濃度的線性關(guān)系,從而計(jì)算樣品中的蛋白含量(mg)。

3)2,3,7,8-TCDD 標(biāo)準(zhǔn)曲線。 以離體的大鼠肝細(xì)胞瘤H4-ⅡE 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,用濃度為0.005 ～200 μg/L 的2,3,7,8-TCDD 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)。 在535 nm 激發(fā)波長和590 nm 吸收波長條件下,測定反應(yīng)終產(chǎn)物RF 的熒光強(qiáng)度和蛋白質(zhì)含量,繪制熒光強(qiáng)度與2,3,7,8-TCDD 濃度之間的劑量-效應(yīng)曲線,并計(jì)算相應(yīng)的半數(shù)有效濃度(EC50)。 酶活關(guān)系曲線由以下Logistic 方程用最小二乘法進(jìn)行擬合:

式中:Y 為EROD 活性;X 為2,3,7,8-TCDD 濃度,即誘導(dǎo)劑量;A 為最大EROD 活性;B 為回歸曲線中線性區(qū)段的斜率;C 為導(dǎo)致半數(shù)最大EROD 活性時(shí)的2,3,7,8-TCDD 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,即EC50;D為最小EROD 活性。

1.2.3 HRGC-HRMS 法檢測

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

HRGC-HRMS 法測得的毒性當(dāng)量(TEQ)是由17 種多氯代二苯并二英/呋喃(PCDD/Fs)異構(gòu)體的實(shí)測值與世界衛(wèi)生組織訂立的毒性當(dāng)量因子(WHO-TEF)相乘得到的,17 種PCDD/Fs 異構(gòu)體的TEQ 之和為樣品中二英類物質(zhì)的總毒性當(dāng)量濃度(后文用WHO-TEQ 表示)。

將樣品酶活性代入2,3,7,8-TCDD 標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到樣品的2,3,7,8-TCDD 毒性當(dāng)量(后文用Bio-TEQ 表示)。

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2003、SPSS 19.0 進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析, 采用 Explore 統(tǒng)計(jì)過程和Kolmogorov-Smimov 檢驗(yàn)確認(rèn)數(shù)據(jù)是否呈良好的正態(tài)分布,采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或ANOVA 進(jìn)行平均值顯著性差異檢驗(yàn),顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 EROD 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及Bio-TEQ 計(jì)算

圖1 和圖2 分別為RF 濃度和蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸系數(shù)分別為0.999 9 和0.999 7。由圖1 和圖2 可知,在檢測濃度范圍內(nèi),RF 濃度與熒光值、蛋白濃度與吸光值之間具有極好的線性關(guān)系。

圖1 RF 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for resorufin analysis

圖2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for bovine serum protein

在進(jìn)行樣品檢測時(shí),EROD 活性用樣品中RF 的值除以蛋白含量和反應(yīng)時(shí)間表示[pmol/(min·mg)]。利用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)物2,3,7,8-TCDD 誘導(dǎo)的EROD 活性作劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。

圖3 2,3,7,8-TCDD 誘導(dǎo)的EROD活性劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard dose-effect curve of EROD activity induced by 2,3,7,8-TCDD

根據(jù)2,3,7,8-TCDD 誘導(dǎo)的EROD 活性劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線得出,EC50為0.49 μg/L,檢測區(qū)間為0.05 ～10 μg/L。 該EC50與SHEN 等[24](0.45 μg/L)、馮忠孚等[21](0.75 μg/L)的研究結(jié)果處于同一個(gè)數(shù)量級,說明本研究建立的檢測體系與其他研究的研究結(jié)果具有良好的可比性。 綜上,RF 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線、蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和EROD 活性劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線均符合檢測要求,檢測數(shù)據(jù)可靠,適用于二英類物質(zhì)的檢測。

2.2 飛灰樣品中二英的回收率

本研究進(jìn)一步開展了對生物檢測方法前處理過程的改進(jìn)工作,盡量消除樣品中的非二英類污染物對檢測結(jié)果的影響,再探究其與儀器分析法的可比性。

表1 不同前處理方式下飛灰樣品中二英的回收率Table 1 Recovery rate of dioxins in fly ash with different pretreatment %

表1 不同前處理方式下飛灰樣品中二英的回收率Table 1 Recovery rate of dioxins in fly ash with different pretreatment %

注:“a”“b”“c”中,對于同一樣品,不同字母表示不同前處理方式的檢測結(jié)果之間存在顯著差異。

檢測指標(biāo) 樣品 EP-DMSO EP-Mix 梨形燒瓶-Mix KW2 36.70a 64.41b 74.16c PCDD/Fs KW4 37.67a 61.11b 88.66c FH2 30.73a 40.59b 99.36c

2.3 飛灰樣品中二英類物質(zhì)的TEQ

采用細(xì)分前處理手段結(jié)合梨形燒瓶-Mix 前處理手段,利用EROD 法檢測分析了我國南部地區(qū)3 家垃圾焚燒廠飛灰樣品中的二英類物質(zhì)水平,同時(shí)采用HRGC-HRMS 法對相同樣品進(jìn)行了檢測。 如表2 所示,EROD 法和HRGC-HRMS 法檢測得到的同一飛灰樣品中PCDD/Fs 的TEQ 無顯著差異。 將檢測數(shù)據(jù)與不同研究團(tuán)隊(duì)采用生物檢測法與儀器分析法測定的環(huán)境樣品二英類污染物含量數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。 從表3 可以看出,采用傳統(tǒng)生物檢測法測得的檢測值普遍高于儀器分析法,且不同方法的檢測數(shù)據(jù)之間存在顯著差異,說明本研究所采用的改進(jìn)后前處理過程能夠消除樣品中的干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響,其檢測結(jié)果與儀器分析法的檢測結(jié)果具有良好的可比性,采用生物檢測法替代儀器分析法檢測二英類污染物已成為可能。

表2 飛灰樣品二英檢測結(jié)果Table 2 Dioxin detected results in fly ash ng/kg

表2 飛灰樣品二英檢測結(jié)果Table 2 Dioxin detected results in fly ash ng/kg

注:對于同一樣品,“a”表示不同檢測方法的檢測結(jié)果之間無顯著差異。

檢測物 樣品 WHO-TEQ Bio-TEQ KW2 1.65a 1.52a PCDD/Fs KW4 1.92a 2.09a FH2 0.175a 0.173a

表3 樣品中二英類物質(zhì)的TEQTable 3 Toxicity equivalent quantity of dioxin in samples

表3 樣品中二英類物質(zhì)的TEQTable 3 Toxicity equivalent quantity of dioxin in samples

注:“a”“b”中,對于同一樣品,不同字母表示不同檢測方法的檢測結(jié)果之間存在顯著差異,相同字母表示不存在顯著差異。

檢測物 樣品 Bio-TEQ WHO-TEQ 參考文獻(xiàn)飛灰1/(ng/kg) 1 020.45a 921.17a [27]PCDD/Fs飛灰2/(ng/kg) 845.78a 738.69a [27]沉積物/(ng/kg) 5.4a 1.6b [28]土壤/(ng/kg) 1.8a 0.1b [28]土壤/(ng/kg) 1 480a 1 300a [29]土壤1/(ng/kg) 146 a 48 b [23]沉積物1/(ng/kg) 76 a 32 b [23]焚燒廢氣1/(pg/m3) 12.1 a 2.5 b [21]焚燒廢氣2/(pg/m3) 18.7a 9.7a [21]廢氣/(ng/m3) 2.7a 2.5a [22]

3 結(jié)論