蔣新龍 吳小剛 郭葉瑩 陳品品 葉小霞 蔣益花

(浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

鞣花酸是廣泛存在于各種軟果、堅(jiān)果等植物組織中的天然多酚類(lèi)物質(zhì)，是一種多酚二內(nèi)酯，是沒(méi)食子酸的二聚衍生物，呈反式?jīng)]食子酸單寧結(jié)構(gòu)[1]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、皮膚增白等多種生物活性[2-4]。但由于鞣花酸分子的剛性平面結(jié)構(gòu)，在水、脂質(zhì)介質(zhì)中均難以溶解，生物利用度低，嚴(yán)重制約了它的應(yīng)用范圍[5，6]。

為了克服鞣花酸水溶性差、藥效短暫等問(wèn)題，許多國(guó)內(nèi)外科研工作者紛紛運(yùn)用各種技術(shù)進(jìn)行研究。馬晶等[7]采用海藻酸鈉/殼聚糖對(duì)石榴皮鞣花酸進(jìn)行包裹制備成復(fù)合物微球，發(fā)現(xiàn)把石榴皮鞣花酸做成海藻酸鈉/殼聚糖微球，可以控制所需鞣花酸的緩慢釋放，能夠保證微球具有更好的生物相容性；范高福等[8]采用以羥丙基-β-環(huán)糊精為包合材料，分別采用溶液研磨法、超聲法、攪拌-超聲法制備石榴鞣花酸-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，其包合物的表觀溶解度提高了約10倍；山田泰司等[9]發(fā)現(xiàn)將含有番石榴葉提取物并且在固體成分中含有1～5%的游離鞣花酸的原料與水性介質(zhì)混合，可以制備在水中的溶解性優(yōu)異的鞣花酸組合物；山田泰司等[10]還發(fā)現(xiàn)將水溶性多酚類(lèi)混合于難水溶性多酚類(lèi)通過(guò)高溫處理可以提高難水溶性多酚類(lèi)溶于水中的溶解濃度；趙修華等[11]用反溶劑法制備了水溶性較好的鞣花酸超微粉；鄭丹丹等[12]將鞣花酸溶于乳劑基質(zhì)中制備成鞣花酸自微乳藥物，提高了鞣花酸的溶解度和生物利用度。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，多酚類(lèi)化合物與磷脂之間具有特殊的親和力，通過(guò)制備磷脂復(fù)合物，可以改善多酚類(lèi)化合的脂溶性[13-17]。本團(tuán)隊(duì)也制備了槐花黃酮磷脂復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物在水和在正辛醇中溶解性都有明顯改善[18]，但鞣花酸磷脂復(fù)合物制備以提高鞣花酸的溶解度和生物活性鮮有報(bào)道。

本研究以石榴皮鞣花酸為原料采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)制備鞣花酸磷脂復(fù)合物，利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化制備工藝條件，并初步探索該復(fù)合物的理化性質(zhì)及其對(duì)植物油抗氧化作用，為開(kāi)拓石榴皮鞣花酸的應(yīng)用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴皮鞣花酸(90%)、植物油為新鮮精煉核桃油和葡萄籽油、鞣花酸(476-66-4標(biāo)準(zhǔn)品，98%)、大豆卵磷脂(磷脂酸PA4-7，磷脂酰肌醇PI12-15，磷脂酰乙醇胺PE18-22，磷脂酰膽堿PC22-25)；其他試劑均為分析純。

UV-1600型紫外可見(jiàn)光譜儀，UV2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，TENSOR27紅外光譜儀，CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀，F(xiàn)W100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石榴皮鞣花酸的含量測(cè)定

鞣花酸含量的測(cè)定：采用紫外分光光度法測(cè)定鞣花酸得率[19]。精確稱(chēng)取0.01 g鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品，在常溫?cái)噭?dòng)下滴加4 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液溶解，再用水定容至100 mL配制成100 μg/mL鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。將鞣花酸標(biāo)液稀釋至一定濃度，在200～400 nm波長(zhǎng)掃描，確定278 nm為最大吸收波長(zhǎng)。再依據(jù)鄧小莉等[18]方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到鞣花酸質(zhì)量濃度C(μg/mL)與吸光度A之間的關(guān)系式為：A=0.062 6C-0.009 6，其線性范圍為0.00～10.00 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6。待測(cè)樣品同法在278 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算鞣花酸含量。

1.2.2 鞣花酸磷脂復(fù)合物制備實(shí)驗(yàn)

以石榴皮鞣花酸和大豆卵磷脂為原料，采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)，參考制備槐花黃酮磷脂復(fù)合物方法[18]，制備鞣花酸磷脂復(fù)合物。以鞣花酸與磷脂的復(fù)合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

單因素實(shí)驗(yàn)：固定初始條件其他量不變，采用控制變量法，考察投料比(磷脂與鞣花酸的質(zhì)量比)、鞣花酸質(zhì)量濃度、微波功率和反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)復(fù)合率的影響。超聲條件固定(超聲輸出功率50 W，頻率40 kHz)，分別設(shè)置鞣花酸質(zhì)量濃度梯度1、3、5、7、10 mg/mL；投料比梯度1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6；微波功率梯度100、150、200、250、300 W；反應(yīng)時(shí)間梯度20、25、30、35、40 min。

正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇鞣花酸質(zhì)量濃度、投料比、微波功率和反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素為主要變量，以復(fù)合率為指標(biāo)，采用 L9(43)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 鞣花酸磷脂復(fù)合物的理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

光譜分析：將一定量的磷脂、鞣花酸、鞣花酸磷脂復(fù)合物分別溶于無(wú)水乙醇溶液中，制成一定濃度的乙醇溶液，將3種溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描；采用KBr壓片法分別對(duì)磷脂、鞣花酸磷脂復(fù)合物在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

溶解度的測(cè)定：取20 mL溶劑(正辛醇、水)，分別加入過(guò)量的鞣花酸或鞣花酸磷脂復(fù)合物于室溫下攪拌6 h，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，測(cè)定其上清液濃度，計(jì)算溶解度。

1.2.3 鞣花酸磷脂復(fù)合物對(duì)植物油抗氧化影響實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 鞣花酸磷脂復(fù)合物植物油樣品液的制備

鞣花酸磷脂復(fù)合物油母液的制備：考慮鞣花酸磷脂復(fù)合物的脂溶性不強(qiáng)，根據(jù)GB 2760—2014《國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》和褚盼盼等[20]研究方法，將4%聚甘油酯加入植物油中，混合均勻，再加入0.1%的鞣花酸磷脂復(fù)合物，均質(zhì)化處理10 min(1 000 r/min)，即得鞣花酸磷脂復(fù)合物油母液。

參照 GB 2760—2014中一般在植物油脂中加入天然抗氧化劑用量，本實(shí)驗(yàn)鞣花酸磷脂復(fù)合物濃度梯度設(shè)置為 0.01%～0.06%。按設(shè)計(jì)所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)將適量的鞣花酸磷脂復(fù)合物母液添加到植物油中，磁力攪拌至鞣花酸磷脂復(fù)合物母液與植物油充分混勻，得到系列鞣花酸磷脂復(fù)合物植物油樣。

以油脂的過(guò)氧化值為衡量指標(biāo)[21]，用所得到的系列鞣花酸磷脂復(fù)合物植物油樣，采用GB/T5538—2005法測(cè)定過(guò)氧化值，分別測(cè)定常溫下和98 ℃加熱 6 h 后的POV值，根據(jù)加熱后過(guò)氧化值的相對(duì)大小，確定最佳添加量。

1.2.3.2 植物油表觀活化能測(cè)定

采用Schaal烘箱法[22]測(cè)定樣品POV隨貯藏溫度、時(shí)間的變化。將最佳鞣花酸磷脂復(fù)合物添加量的植物油置于碘量瓶中密封，分別測(cè)定每隔2 d(共10 d)的置于45、55、65 ℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中的樣品POV0。同法空白參照。

植物油的氧化、添加促氧化劑和抗氧化劑后植物油的氧化都符合一階動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[23-25]。本研究根據(jù)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程ln(POV/POV0)=-kt，對(duì)加熱時(shí)間t和POV進(jìn)行擬合，得到相關(guān)系數(shù)和回歸方程，求得反應(yīng)速率常數(shù)k。根據(jù)Arrhenius經(jīng)驗(yàn)公式(lnk=lnk0-Ea/RT)，用lnk對(duì)1/T作圖，得到一條斜率為-Ea/R的直線，由斜率求得表觀活化能Ea[18,23]。同法空白參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法及分析軟件

指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次并取平均值，利用Ori gin8軟件作圖，應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用Duncan多重比較(SSR法)檢驗(yàn)各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鞣花酸磷脂復(fù)合物制備

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

投料比的確定：投料比對(duì)復(fù)合率有較大的影響，復(fù)合率隨體系中磷脂比例的增加而增加。圖1可知，在磷脂∶石榴皮鞣花酸質(zhì)量比為3∶1時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最高。說(shuō)明當(dāng)磷脂∶石榴皮鞣花酸質(zhì)量比為3∶1時(shí)，二者的相互作用最充分。

鞣花酸濃度的確定：鞣花酸濃度對(duì)復(fù)合率有較大影響。因?yàn)轺坊ㄋ嵩谌芤褐许毥?jīng)碰撞才能發(fā)生反應(yīng)，合適的濃度有利于反應(yīng)的進(jìn)行[26]。鞣花酸濃度較小，二者相互作用不充分；鞣花酸濃度較大，鞣花酸在溶液中也不能完全碰撞發(fā)生反應(yīng)。圖1可知，在反應(yīng)物濃度為1～5 mg/mL時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率隨著鞣花酸濃度的增大而增大，當(dāng)反應(yīng)物濃度為5 mg/mL時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最高。

反應(yīng)時(shí)間的確定：反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合率有較大影響。反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，反應(yīng)不完全；反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微波的熱效應(yīng)會(huì)使鞣花酸產(chǎn)生降解。圖1可知，在反應(yīng)時(shí)間為20～30 min時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)30 min時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最高。

微波功率的確定：超聲-微波協(xié)同技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)在于能同時(shí)充分利用超聲波的空化作用以及微波的高能作用和熱效應(yīng)。微波功率增加，鞣花酸和磷脂分子的熱力學(xué)活動(dòng)趨于活躍。但微波功率過(guò)大，微波的熱效應(yīng)會(huì)使鞣花酸產(chǎn)生降解；溫度過(guò)高也不利于磷脂復(fù)合物的穩(wěn)定。圖1可知，在微波功率為200 W時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率達(dá)到最大值。

圖1 鞣花酸磷脂復(fù)合物制備條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

表1和表2分別為正交實(shí)驗(yàn)的因子與水平及結(jié)果。

表1 4因子在3水平正交實(shí)驗(yàn)的因子與水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析表

由表2極差R表明，影響復(fù)合率的因素主次依次排列為：鞣花酸質(zhì)量濃度(A)>反應(yīng)時(shí)間(C)>微波功率(D)>投料比(B)。由表3方差分析表明，對(duì)復(fù)合率的影響主次依次排列為：鞣花酸質(zhì)量濃度(A)>反應(yīng)時(shí)間(C)>微波功率(D)>投料比(B)。極差分析和方差分析在復(fù)合率影響主次排列上完全一致。表3還表明，鞣花酸質(zhì)量濃度(A)和反應(yīng)時(shí)間(C)對(duì)復(fù)合率的影響顯著，其他則不顯著。直觀分析，實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合為A1B3C3D3；根據(jù)每個(gè)因素K1、K2、K3實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合為A1B2C3D3。因?yàn)橥读媳?B)1∶2與1∶3、1∶4差異顯著，而投料比1∶3、1∶4之間差異不顯著，綜合分析提取成本和復(fù)合率，確定最佳工藝條件A1B2C3D3，即鞣花酸質(zhì)量濃度3 mg/mL，投料比1∶3 g/g，反應(yīng)時(shí)間35 min，微波功率300 W。因?yàn)樽罴压に嚄l件A1B2C3D3在正交實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)，因此根據(jù)最佳工藝條件進(jìn)行工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行3次，復(fù)合率分別為91.83%、91.79%、91.78%，平均91.80%，高于正交表中其他組合的復(fù)合率，由此證明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 光譜分析

紫外掃描如圖2所示。卵磷脂沒(méi)有共軛結(jié)構(gòu)，卵磷脂只有在215 nm處有紫外最大吸收峰出現(xiàn)；鞣花酸在 265 nm、370 nm處有強(qiáng)烈吸收峰，這是由于鞣花酸具有共軛不飽和結(jié)構(gòu)所致，與單書(shū)香[27]等學(xué)者研究結(jié)果較一致；鞣花酸磷脂復(fù)合物與鞣花酸在紫外圖譜中沒(méi)有顯著差異，只不過(guò)鞣花酸和磷脂的復(fù)合，磷脂的極性基團(tuán)與鞣花酸發(fā)生了較強(qiáng)的非共價(jià)鍵相互作用[28]，因此紫外吸收光譜特征有所改變，表現(xiàn)為最大吸收波長(zhǎng)的少許位移。鞣花酸與卵磷脂在形成復(fù)合物的過(guò)程中僅僅是通過(guò)非共價(jià)結(jié)合，沒(méi)有產(chǎn)生新的共軛結(jié)構(gòu)。

圖2 紫外吸收光譜圖

圖3 紅外吸收光譜圖

而卵磷脂具有羥基(3 358 cm-1)、亞甲基(2 926 cm-1)和羰基(1 740 cm-1)的特征吸收峰。鞣花酸和鞣花酸磷脂復(fù)合物的吸收光譜大致相同，復(fù)合物在掃描范圍內(nèi)吸收峰只出現(xiàn)少許位移并沒(méi)有出現(xiàn)新的吸收峰。鞣花酸在 1 000 cm-1到 1 500 cm-1之間的大部分特征吸收特征峰變化比較大，表明鞣花酸和磷脂在形成復(fù)合物的過(guò)程中不是簡(jiǎn)單的一種混合狀態(tài)，鞣花酸與卵磷脂通過(guò)非共價(jià)鍵發(fā)生了相互作用。

經(jīng)光譜分析初步看出在復(fù)合物中并無(wú)新的化學(xué)鍵生成。從結(jié)構(gòu)上看，磷脂帶有正電性的季胺氮，鞣花酸酚羥基具有負(fù)電性的氧，兩者可產(chǎn)生弱的偶極-偶極相互作用力而使兩分子結(jié)合[30]，形成鞣花酸磷脂復(fù)合物。

2.2.2 溶解度測(cè)定結(jié)果

鞣花酸在25 ℃水中溶解度為 0.606 4 mg/mL；而鞣花酸卵磷脂復(fù)合物在水中的溶解度增加至0.849 2 mg/mL，水溶性增加了1.4倍。鞣花酸在 25 ℃正辛醇中的溶解度為 0.441 9 mg/mL；而鞣花酸卵磷脂復(fù)合物在正辛醇中的溶解度增加至0.917 9 mg/mL，脂溶性增加了2.1倍。相對(duì)槐花黃酮磷脂復(fù)合物對(duì)溶解性的影響(水溶性增加了19.1倍，脂溶性增加了6.4倍)[18]，鞣花酸磷脂復(fù)合物對(duì)溶解性的改善甚微，可能還是因?yàn)轺坊ㄋ岱肿拥膭傂云矫娼Y(jié)構(gòu)起了決定性的作用[5]。

2.3 石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物對(duì)油樣的抗氧化效果

2.3.1 濃度對(duì)石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物抗油脂氧化效果的影響

圖4表明，添加石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物后，隨著其添加量的增加，植物油的過(guò)氧化值逐漸降低，說(shuō)明石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物對(duì)葡萄籽油和核桃油具有抗氧化作用，且對(duì)葡萄籽油和核桃油的抗氧化能力有一定的量效關(guān)系。圖4表明，抗油脂氧化效果最好的是0.06%石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物，用以進(jìn)行Schaal烘箱加速氧化實(shí)驗(yàn)。

圖4 濃度對(duì)石榴皮鞣花酸抗油脂氧化效果影響

表4 植物油過(guò)氧化值的回歸方程及活化能參數(shù)

2.3.2 溫度對(duì)石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物抗油脂氧化效果的影響

由圖5可知，在45、55、65 ℃時(shí)，隨著溫度升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，植物油的過(guò)氧化值逐漸升高，氧化速度加快。鞣花酸磷脂復(fù)合物(EA-PC)、鞣花酸(EA)對(duì)葡萄籽油和核桃油的過(guò)氧化值變化趨勢(shì)大體相同。

圖5 植物油抗氧化穩(wěn)定性在不同溫度、時(shí)間下的變化

由表4可知，根據(jù)1.2.3.2方法得到過(guò)氧化值的回歸方程，回歸系數(shù)R>0.97，擬合度高。植物油的氧化反應(yīng)屬于一級(jí)反應(yīng)，與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[23-25]。比較添加鞣花酸、鞣花酸復(fù)合物及空白對(duì)照的植物油的活化能，活化能的相對(duì)大小依次為：鞣花酸復(fù)合物(EA-PC)>鞣花酸(EA)>不添加，而且添加鞣花酸復(fù)合物比添加鞣花酸和不添加升高明顯。說(shuō)明添加石榴皮鞣花酸磷脂復(fù)合物能提高相應(yīng)植物油的抗氧化性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與槐花黃酮磷脂復(fù)合物對(duì)植物油的抗氧化性影響相似[18]。其主要原因也是因?yàn)轺坊ㄋ崃字瑥?fù)合物所含可提供氫原子的酚類(lèi)結(jié)構(gòu)，中斷自由基反應(yīng)[31]。

表4同樣表明，表觀活化能增大百分率，核桃油比葡萄籽油增大明顯，說(shuō)明鞣花酸對(duì)核桃油的抗油脂氧化作用比葡萄籽油更好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與槐花黃酮磷脂復(fù)合物相似[18]。比較鞣花酸和槐花黃酮，鞣花酸對(duì)核桃油的抗油脂氧化作用比槐花黃酮更好。究其原因，核桃油與葡萄籽油含有不同的脂肪酸成分[32]，鞣花酸和槐花黃酮也有不同的酚類(lèi)結(jié)構(gòu)，當(dāng)然還有含多不飽和脂肪酸油脂的氧化敏感性較高[32]等原因。

3 結(jié)論

以石榴皮鞣花酸為原料，以復(fù)合率為衡量指標(biāo)，采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)，利用正交設(shè)計(jì)對(duì)制備鞣花酸磷脂復(fù)合物工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。最佳制備工藝為：無(wú)水乙醇為反應(yīng)溶劑，鞣花酸質(zhì)量濃度3 mg/mL，磷脂與鞣花酸的投料質(zhì)量比3∶1，反應(yīng)時(shí)間35 min，微波功率300 W，此制備條件下，鞣花酸磷脂復(fù)合物復(fù)合率為91.80%。

光譜分析表明，鞣花酸與卵磷脂不是簡(jiǎn)單的一種混合狀態(tài)，在形成復(fù)合物的過(guò)程中僅僅是通過(guò)非共價(jià)結(jié)合。磷脂復(fù)合物可改善鞣花酸的溶解性能，脂溶性增加了2.1倍，水溶性增加了1.4倍，改善溶解性能的效果不顯著。

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加鞣花酸磷脂復(fù)合物后植物油的氧化符合一階動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。添加鞣花酸磷脂復(fù)合物后核桃油和葡萄籽油的氧化反應(yīng)活化能都增大，核桃油表觀活化能增大百分率比葡萄籽油大，鞣花酸磷脂復(fù)合物對(duì)核桃油的抗油脂氧化效果更好。