朱 妍 綜述 秦衛(wèi)松 審校

糖尿病是一組由多病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷所引起。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會最新統(tǒng)計，2019年全球有4.63億成人患有糖尿病，成為嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題[1]。

為深入探究糖尿病及其并發(fā)癥，動物模型應用越來越廣泛。糖尿病研究最常使用小型哺乳動物模型，普遍存在成本高、周期長等缺點?？焖佟⒏咝Ш偷统杀镜陌唏R魚動物模型已成為糖尿病研究的重要手段。

斑馬魚模型的特點與評價

生物學特點斑馬魚胰腺起源于兩個芽基，背芽形成于腹芽，背芽形成于胚胎受精后24h(hours post fertilization，hpf)，主要發(fā)育為胰內分泌腺，即初級胰島；34hpf后，腹芽形成，逐漸與背芽融合成胰腺，腹芽可分化為胰內分泌腺和胰外分泌腺。斑馬魚調節(jié)內分泌胰腺發(fā)育的重要基因和信號通路與其他脊椎動物同源保守[2]。受精5d后，斑馬魚胰腺的基本結構和功能與成年哺乳動物胰腺高度相似[3]。對胰島素敏感、參與血糖調節(jié)的其他組織器官(肝臟、肌肉、脂肪組織等)，以及一些糖代謝調控相關的分子機制，與哺乳動物在進化上也具有保守性[4-5]。

CRISPR/Cas9是近幾年發(fā)展具有革命性的基因編輯技術，在斑馬魚研究中的應用已非常成熟。應用CRISPR/Cas9技術在單細胞胚胎階段注射導向RNA(gRNA)和Cas9 mRNA，可快速獲得基因敲除斑馬魚[6]，為研究胰腺疾病和葡萄糖代謝提供理想模型。

評價指標血糖水平是反映胰腺β細胞功能和診斷糖尿病的常用檢測指。Jurczyk等[4]采用熒光素酶分析法檢測斑馬魚胚胎裂解物中葡萄糖的絕對含量，證實斑馬魚關鍵的葡萄糖調節(jié)機制在進化上具有保守性。對于成年斑馬魚，Eames等[7]通過斷頭術取血，用血糖儀和試紙測量斑馬魚空腹和餐后血糖，并進行腹膜內葡萄糖耐量檢測，結果證實斑馬魚血糖的動態(tài)調節(jié)。Zang等[8]開發(fā)出在同一斑馬魚個體重復采血的方式，可有效避免斑馬魚的死亡。近年新型的熒光葡萄糖類似物，例如葡萄糖攝取熒光探針(2-NBDG)、Cy3標記的葡萄糖生物探針(GB2-Cy3)等，可作為體內葡萄糖生物探針，監(jiān)測斑馬魚細胞葡萄糖攝取水平[9]。利用斑馬魚胚胎透明的特點，Huang等10]構建了轉基因品系Tg(ins:GFP)，insulin啟動子介導綠色熒光蛋白(GFP)表達，顯微鏡下即可觀察斑馬魚胰腺β細胞的數(shù)量和范圍。另外，胰島素和胰高血糖素的mRNA水平可通過qPCR測定[11]。AKT磷酸化可以衡量胰島素受體活性，當AKT磷酸化的水平降低，表明胰島素信號通路受損，可作為斑馬魚胰島素抵抗的指標[5]。

1型糖尿病模型

1型糖尿病(T1DM)是由于免疫介導或特發(fā)性胰島β細胞破壞，導致胰島素絕對缺乏。根據(jù)誘導β細胞減少的模式不同，可分為藥物誘導性和基因修飾誘導性T1DM模型。

藥物誘導性模型早期利用轉基因斑馬魚Tg(-1.0ins: eGFP)可在熒光顯微鏡下觀察的特點，手術切除表達熒光蛋白的胰島組織以誘發(fā)高血糖[12]。但此方法創(chuàng)傷大、成功率低，逐漸被藥物誘導刪減β細胞取代。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan)可誘導胰腺β細胞凋亡，已應用于多種糖尿病實驗動物模型。腹膜內注射STZ誘導T1DM的成年斑馬魚模型，不僅表現(xiàn)出空腹血糖增高和血清胰島素水平下降，而且出現(xiàn)視網(wǎng)膜、腎臟損傷，傷口愈合不良和尾鰭再生受損[13-14]。腹膜內注射四氧嘧啶也可導致β細胞壞死，但具有高致死率[12]。Benchoula等[15]提出了四氧嘧啶誘導模型的優(yōu)化方案，即單次腹腔注射300 mg/kg的四氧嘧啶是誘導斑馬魚高血糖的最佳劑量。此方法降低四氧嘧啶的毒副作用，延長了高血糖癥維持時間。

基因修飾誘導性模型隨著轉基因技術的發(fā)展，可在一定條件下靶向編輯基因，使斑馬魚達到高血糖狀態(tài)。Li等[16]構建了轉基因品系Tg(1.2ins:htBidTE-ON;LR)，利用四環(huán)素和蛻皮素雙重作用于TetOn系統(tǒng)，特異性刪除β細胞，導致胰島素絕對缺乏。另一種轉基因品系Tg(1.2ins:Kir6.2CA-GFPTE-ON; LR)，Kir6.2編碼β細胞膜上ATP依賴的K+通道的主要亞基，通過四環(huán)素誘導鉀離子持續(xù)流出，細胞膜超極化，使胰島素分泌減少，β細胞代償性分化減少。在轉基因魚Tg(ins：Cre)介導下，Tg(ins:loxp:BFPloxp:DTA)的β細胞特異性表達致死性白喉毒素α，可致細胞完全消除。β細胞缺失的斑馬魚幼魚表現(xiàn)出更高的游離葡萄糖水平，且存在顯著的發(fā)育遲緩[17]。

Pisharath等利用大腸桿菌的硝基還原酶基因(nitroreductase，NTR)，構建轉基因斑馬魚Tg(T2Kins:nfsB-mCherry)，該斑馬魚胰腺β細胞表達NTR和mCherry的融合熒光蛋白，用甲硝唑(metronidazole，MTZ)處理轉基因魚，無毒性的MTZ被NTR還原為細胞毒性的代謝產物，特異性致死胰腺β細胞，最終引起血糖升高[18]。

2型糖尿病(T2DM)模型

T2DM的主要特點是胰島素抵抗和β細胞胰島素分泌缺陷。T2DM斑馬魚模型可分為誘發(fā)性模型和自發(fā)性模型。

誘發(fā)性模型成年斑馬魚的平均空腹血糖水平74±8.5 mg/dl，高于三倍正常值被認為是高血糖(>200 mg/dl)。Gleeson等[19]用2%和0%的葡萄糖溶液交替浸泡28天，通過高糖暴露法建立斑馬魚糖尿病模型。最終斑馬魚血糖呈波動性升高，合并視網(wǎng)膜病變[19]。此外，用高糖溶液連續(xù)浸泡斑馬魚14天，觀察到斑馬魚血糖持續(xù)升高，對外源性胰島素反應減弱，肌肉胰島素受體mRNA水平降低，格列美脲和二甲雙胍治療后改善高糖代謝[20]。

肥胖是哺乳動物T2DM的誘因之一，Zang等[21]通過飲食誘發(fā)肥胖，建立T2DM模型。將4～6個月健康成年斑馬魚分成正常喂養(yǎng)和六倍食量喂養(yǎng)，三個月后，過度喂養(yǎng)的斑馬魚空腹血糖水平顯著升高。腹膜內葡萄糖耐量和口服葡萄糖耐量試驗表明，過度喂養(yǎng)導致葡萄糖耐量受損，降糖藥物治療后顯著緩解高血糖，與2型糖尿病胰島素抵抗表型相似。甲基乙二醛是終末糖基化產物(AGEs)的主要前體，短暫敲低乙二醛酶1可導致內源性甲基乙二醛水平升高和血管改變，而永久敲除乙二醛酶1建立glo1-/-斑馬魚突變體，自發(fā)出現(xiàn)餐后血糖升高，葡萄糖耐量受損，進一步飲食誘導肥胖，成年斑馬魚表現(xiàn)出空腹血糖升高和視網(wǎng)膜血管改變，提示高營養(yǎng)攝入增加了乙二醛酶1缺乏對2型糖尿病的遺傳易感性[22]。

自發(fā)性模型Maddison等[5]利用顯性負性作用(dominant negative effect)，構建胰島素樣生長因子1受體(insulin like growth factor 1 receptor，IGF-1R)的顯性負性突變體。利用α肌動蛋白啟動子，建立骨骼肌胰島素抵抗的斑馬魚模型Tg(acta1:dnIGF1R-EGFP) 。該模型最初表現(xiàn)為胰腺β細胞代償性增加和正常的葡萄糖耐量。隨著年齡增長和飲食攝入，逐漸出現(xiàn)空腹血糖增高，β細胞數(shù)量減少和胰島素抵抗等。

瘦素(Leptin，LP)是由哺乳動物脂肪組織產生的一種脂肪抑制因子，瘦素/瘦素受體缺乏的小鼠和人表現(xiàn)出食欲亢進、肥胖、糖尿病和不育癥。研究表明，盡管缺乏瘦素受體的成年斑馬魚不表現(xiàn)出食欲增加或肥胖，但瘦素受體突變的幼魚胰島β細胞數(shù)量增加，胰島素mRNA水平升高，葡萄糖穩(wěn)態(tài)受到影響[11]。

白介素1β(IL-1β)在胰島炎癥反應中發(fā)揮著重要作用，通過核因子κB(NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等途徑可介導β細胞凋亡。Luis等開發(fā)出IL-1β介導胰島炎癥的斑馬魚模型 Tg(ins:il1b)，預先刪除IL-1β部分氨基酸，模擬被caspase-1切割后的活化形式，隨后產生的炎癥反應特異性損傷β細胞的功能和特性，表現(xiàn)出葡萄糖刺激后的鈣內流顯著減少，β細胞成熟和功能相關的基因表達下降，如轉錄因子Pdx1、2型糖尿病風險基因kcnj11等，出現(xiàn)葡萄糖耐量受損和高血糖癥。由于該模型直接在β細胞中過表達IL-1β，與糖尿病病理生理模式存在一定差異[23]。Yin等[24]利用Cas9和多個sgRNA表達，建立了多重條件的誘變系統(tǒng)。條件性CRISPR誘導表達可以在時間和空間上控制Cas9表達，并且能同時靶向多個基因，提高效率，達到消除冗余或分析基因-基因互作的目的。以此構建的肝臟胰島素抵抗斑馬魚Tg(fabp10:Cas9;CG);(U6x:sgRNA(insra/b);LC)，肝臟特異性啟動子fabp表達Cas9，胰島素受體基因insra、insrb同時表達gRNA，造成肝臟葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡，導致空腹低血糖和餐后顯著高血糖。

特殊類型糖尿病模型

青年人中的成年發(fā)病型糖尿病(maturity-onset diabetes melitus，MODY),是由單基因突變的胰島β細胞功能遺傳缺陷所致的糖尿病，具有發(fā)病年齡早、常染色體顯性遺傳的特點。

變異的肝細胞核因子1(variant hepatocyte nuclear factor 1，vHnf1)的同源突變與MODY5有關，vHnf1斑馬魚突變體的表現(xiàn)出胰腺和肝臟發(fā)育不全、腎囊腫，但vHnf1功能嚴重喪失的突變體，前腸局部缺陷和胰腺發(fā)育不全限制其作為研究胰腺功能模型的實用性[25]。在新型hnf1ba斑馬魚突變體中，hnf1ba功能部分喪失，導致MODY5樣胰腺發(fā)育不全、β細胞數(shù)量減少，且不表現(xiàn)出明顯的前腸內胚層區(qū)域性缺陷[26]。

妊娠糖尿病模型

妊娠糖尿病對胎兒的發(fā)育具有深遠的影響，Singh等[27]用脈沖式高糖暴露法，將野生型斑馬魚胚胎每間隔24h暴露于高糖環(huán)境，模擬妊娠糖尿病母體子宮內血糖水平的變化。與對照組相比，高糖組斑馬魚胚胎總游離葡萄糖水平呈劑量依賴性波動，平均游離葡萄糖水平顯著增高，值得注意的是，高糖幼魚同時具有明顯的視網(wǎng)膜發(fā)育缺陷，視網(wǎng)膜細胞層厚度改變， Müeller膠質細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)量減少。

糖尿病并發(fā)癥模型

長期高血糖以及代謝紊亂可引起多系統(tǒng)損害，導致眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織器官慢性進行性病變、功能減退及衰竭。斑馬魚模型廣泛用于糖尿病并發(fā)癥的研究。

微血管并發(fā)癥糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見的微血管病變，是失明的主要原因之一。暴露于高糖溶液的斑馬魚視網(wǎng)膜內網(wǎng)層(inner plexiform layer,IPL)和內核層(inner nuclear layer，INL)均比正常組減少，IPL顯著變薄，與其他糖尿病動物模型和糖尿病患者表型相似[19]。Jung等[28]用高糖處理斑馬魚胚胎，第六天觀察到玻璃體-視網(wǎng)膜血管擴張伴形態(tài)學損傷，緊密連接蛋白破壞，血管內皮生長因子(VEGF) mRNA和NO增多，這種短期糖尿病視網(wǎng)膜病變的模型將是用于篩選DR的潛在治療藥物的有效工具。最近，Wiggenhauser等[29]通過CRISPR/Cas9技術敲除轉錄因子Pdx1，pdx1-/-突變體表現(xiàn)出胰腺發(fā)育障礙和高血糖癥，并且幼魚血管擴張，通透性增加。高血糖誘發(fā)的早期血管表型可持續(xù)到成年期，視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)中血管改變加劇，導致血管超支化。VEGF和NO抑制劑和降糖藥物可緩解高血糖引起的血管改變，但pdx1-/-突變體較高的死亡率限制其成年期應用。

表1 不同基因修飾的糖尿病斑馬魚模型

腎臟并發(fā)癥糖尿病腎病是糖尿病所致的慢性疾病，也是導致終末期腎病的主要原因。STZ誘導的1型糖尿病斑馬魚，在第3周時顯示腎小球基膜(GBM)增厚[14]。Sharma等[30]發(fā)現(xiàn)利用反義嗎啉環(huán)寡核苷酸(morpholino，MO)技術敲降Pdx1誘導出斑馬魚高血糖，導致了前腎腎小球擴張，濾過屏障高度萎縮。在敲降Pdx1的高血糖斑馬魚模型基礎上，同時敲降促紅細胞生成素(erythropoietin， EPO)，可見腎臟損傷加重，腎小球長度進一步增加，前腎頸部顯著縮短，揭示了EPO在糖尿病腎病中的保護機制[31]。

神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥Dorsemans等[32]建立急性高血糖的新模型，以探究急性和慢性高血糖對腦穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)再生的影響。研究表明，急性高血糖會增加大腦促炎性細胞因子的表達，而慢性高血糖癥減少了腦細胞增殖和血腦屏障形成有關的基因表達。此外，高血糖會調節(jié)斑馬魚乙酰膽堿酯酶功能和基因表達，使膽堿功能障礙，最終導致記憶力減退，加蘭他敏能夠逆轉由高血糖引起的記憶缺陷[33]。Rocker等通過NTR/MTZ介導的β細胞消除，高血糖幼魚運動神經(jīng)元減少，緊密連接破壞，Schwann細胞數(shù)量改變，驗證高血糖對斑馬魚周圍神經(jīng)系統(tǒng)的影響[34]。

心血管并發(fā)癥高血糖是心臟損害的獨立危險因素，可導致糖尿病性心肌病。Sun等[35]成功建立糖尿病心肌病的成年斑馬魚模型。高糖處理的斑馬魚逐漸出現(xiàn)心肌肥大、細胞凋亡和心律失常。超聲心動圖顯示心臟早期舒張功能障礙和晚期收縮功能障礙，與糖尿病患者的觀察結果一致，證實高血糖會誘導成年斑馬魚的心臟重塑和功能障礙。

小結:斑馬魚具有嚙齒類動物不具備的獨特優(yōu)勢，易于轉基因操作，構建動物模型快速、高效，可以從分子水平精準分析疾病致病機制，有效彌補了體外細胞實驗和傳統(tǒng)嚙齒類動物實驗之間的生物學實驗斷層。斑馬魚胰腺的結構、功能和糖代謝調控等與哺乳動物高度保守，已經(jīng)廣泛應用于胰腺發(fā)育生物學研究、不同類型糖尿病及其并發(fā)癥研究，以及糖尿病新藥篩選、藥物毒性等領域。多樣化的糖尿病斑馬魚模型仍在不斷構建中，將在糖尿病疾病研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。