王 潔，張?jiān)魄?，趙 斌，尹香利,2

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安 716000；2.渭南市中心醫(yī)院，陜西 渭南 714000)

細(xì)胞衰老是導(dǎo)致衰老相關(guān)性疾病(包括慢性炎癥和腫瘤)的主要機(jī)制，通過清除衰老細(xì)胞或調(diào)控衰老相關(guān)標(biāo)志物治療衰老相關(guān)性疾病和腫瘤正受到越來越多的關(guān)注。近年來，細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相繼揭示了癌基因誘發(fā)的細(xì)胞衰老與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[1-5]。胃癌是全球高發(fā)腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康[6-9]。胃癌的發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多階段的過程，細(xì)胞衰老與細(xì)胞增殖在其中起著重要的作用，P53、P16INK4a、衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)是細(xì)胞衰老過程中重要的調(diào)控因子。K-ras是RAS基因家族成員之一，與腫瘤的發(fā)展及增殖有很大關(guān)系。本研究通過觀察K-ras、P16INK4a、P53、SA-β-Gal等在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，分析K-ras能否誘導(dǎo)細(xì)胞衰老以及細(xì)胞衰老與癌前病變的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集延安大學(xué)附屬醫(yī)院2016—2017年具有完整手術(shù)切除記錄的138例胃管狀腺癌患者的病理樣本。其中，女性35例，男性103例；年齡38～90歲，中位年齡62歲，57例患者≤52歲，81例>52歲；57例發(fā)生于近端胃，81例發(fā)生于遠(yuǎn)端胃；腫瘤大小>5 cm者73例，≤5 cm者65例；高分化者25例，中分化者62例，低分化者51例；pTNM分期Ⅰ-Ⅱ期67例，Ⅲ期71例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移77例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例；4例查見脈管內(nèi)癌栓，5例查見周圍神經(jīng)侵犯。所有患者均為新診斷病例，且術(shù)前均未經(jīng)過放化療及免疫治療。

1.2 主要試劑 K-ras(ab180772)、SA-β-Gal(ab4761)購自Abcam公司，P16INK4a、P53免疫組化Elivision試劑盒(2011099921H)及DAB顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化染色 所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，切片厚4 μm，檸檬酸緩沖液修復(fù)，EliVision二步法免疫組化染色所用P16INK4a、K-ras、SA-β-Gal抗體稀釋滴度為1∶100，均設(shè)陽性與陰性對照。具體步驟：逐級脫蠟水化；檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)；封酶水洗；一抗室溫孵育60 min；二抗室溫孵育15 min；DAB顯色3～5 min；蘇木素復(fù)染；脫水、透明和封片。

1.4 結(jié)果判定 每切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，按視野中陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例定義陽性與陰性。如果無陽性著色或陽性細(xì)胞數(shù)<10%，則定義為陰性染色；當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)≥10%時(shí)，定義為陽性染色。K-ras以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色為陽性細(xì)胞；P53以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色染色為陽性細(xì)胞；P16INK4a以細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色為陽性細(xì)胞；SA-β-Gal以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽性細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。胃癌及癌前病變組織中各項(xiàng)檢測指標(biāo)的差異、K-ras蛋白與衰老相關(guān)標(biāo)記物(P16INK4a、P53、SA-β-Gal)的相關(guān)性分析采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌及癌旁組織染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示：癌旁組織中胃黏膜固有腺減少，腺體之間間距增大，間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)不等量的淋巴細(xì)胞浸潤，部分腺體發(fā)生了腸上皮化生，表現(xiàn)為慢性萎縮性胃炎(圖1A)；胃癌組織病理學(xué)表現(xiàn)為管狀腺癌，高、中分化腺癌腺體可見不規(guī)則的腺管結(jié)構(gòu)，低分化腺癌無明顯腺管形成，癌細(xì)胞呈散在、巢狀或線狀排列，細(xì)胞異型性顯著，可見核分裂像(圖1B)。免疫組化染色結(jié)果顯示：胃管狀腺癌組織中K-ras陽性表達(dá)，呈細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)棕黃色染色(圖1C)；胃管狀腺癌組織中P53陽性表達(dá)，呈中-高強(qiáng)度細(xì)胞核棕黃色染色(圖1D)；P16INK4a蛋白陽性表達(dá)，腺管或癌細(xì)胞細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀染色(圖1E)；胃管狀腺癌組織中SA-β-Gal蛋白陽性表達(dá)，細(xì)胞膜呈棕黃色染色(圖1F)。

注：A為癌旁組織HE染色；B為胃管狀腺癌HE染色；C-F依次為胃管狀腺癌K-ras、P53、P16INK4a及SA-β-Gal免疫組化染色(EliVision法)

2.2 胃癌與癌旁組織K-ras表達(dá)水平比較 胃癌組織中K-ras陽性表達(dá)者132例，陽性率為95.70%，癌旁組織中K-ras陽性表達(dá)者5例，陽性率僅為3.60%，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=233.77，P<0.05)。

2.3 胃癌組織中K-ras與P16INK4a、P53、SA-β-Gal相關(guān)性分析 見表1。胃癌組織中，K-ras陽性組P53、SA-β-Gal、P16INK4a陽性表達(dá)率均明顯高于K-ras陰性組(均P<0.05)，提示癌組織中K-ras基因可能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。

表1 胃癌組織中K-ras與P16INK4a、P53、SA-β-Gal相關(guān)性分析[例(%)]

2.4 癌旁組織中K-ras與P16INK4a、P53、SA-β-Gal相關(guān)性分析 見表2。癌旁組織中，K-ras陽性組P53、SA-β-Gal、P16INK4a陽性表達(dá)率均顯著高于K-ras陰性組(均P<0.05)，提示在胃癌的癌前病變中也存在由K-ras誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老現(xiàn)象。

表2 癌旁組織中K-ras與P16INK4a、P53、SA-β-Gal相關(guān)性分析[例(%)]

3 討 論

本研究檢測了K-ras以及細(xì)胞衰老標(biāo)志物P53、P16INK4a、SA-β-Gal在胃癌組織及癌前病變組織中的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，胃癌組織K-ras的表達(dá)顯著高于癌前病變，說明癌基因K-ras的激活可能參與胃癌的發(fā)生及發(fā)展過程。此外，K-ras陽性組衰老相關(guān)指標(biāo)物P53、P16INK4a、SA-β-Gal的表達(dá)均顯著高于K-ras陰性組，表明胃癌組織中的K-ras基因可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老。因此，K-ras相關(guān)的細(xì)胞衰老對胃癌的發(fā)生和發(fā)展具有推波助瀾的作用。

癌基因表達(dá)不斷增加及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的累積與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究[10]顯示，RAS、Myc等癌基因過度表達(dá)可誘發(fā)細(xì)胞衰老和(或)細(xì)胞凋亡，誘發(fā)細(xì)胞進(jìn)入非增殖但可存活的衰老狀態(tài)，癌細(xì)胞可通過抑制細(xì)胞衰老或凋亡從而適應(yīng)高水平的致癌信號(hào)傳導(dǎo)，這種現(xiàn)象稱為癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老(OIS)。細(xì)胞衰老這一術(shù)語是Hayflick于1961年提出的，因體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞具有增殖極限的現(xiàn)象[11]。細(xì)胞衰老曾被認(rèn)為是機(jī)體的一種自我防御和修復(fù)機(jī)制，原癌基因也可以激活DNA損傷反應(yīng)來誘發(fā)細(xì)胞的衰老。

細(xì)胞周期抑制劑P16INK4a、P53與SA-β-Gal是常見的細(xì)胞衰老分子標(biāo)志物。正常情況下，這些細(xì)胞周期抑制劑陽性表達(dá)可以通過P16INK4a/pRB、P53/P21[12]和Wnt[13]等信號(hào)通路發(fā)揮作用，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而，當(dāng)這些腫瘤抑制分子突變或失活后，若衰老細(xì)胞中受損DNA不能及時(shí)被修復(fù)，可使得部分衰老細(xì)胞獲得惡性表型，從而誘發(fā)腫瘤發(fā)生與異常增殖。盡管本研究發(fā)現(xiàn)胃癌及癌前病變中均存在K-ras誘發(fā)的細(xì)胞衰老，但在胃癌組織中K-ras及細(xì)胞衰老相關(guān)標(biāo)志物的陽性表達(dá)率高于癌前病變，間接表明了K-ras誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老在慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生等胃癌癌前病變胃黏膜腺體中持續(xù)存在，若能在合適的微觀調(diào)控作用下使這些癌前病變腺上皮細(xì)胞高表達(dá)衰老相關(guān)標(biāo)記物并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，則將有望將腫瘤扼殺在萌芽階段。

細(xì)胞衰老是一把雙刃劍，正常情況下體內(nèi)的衰老細(xì)胞可被巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞清除，永久性地從細(xì)胞周期中撤離，從而阻斷了腫瘤的發(fā)生。但當(dāng)這些衰老的細(xì)胞多年未被及時(shí)地清除而保持衰老狀態(tài)時(shí)，這些衰老細(xì)胞將伴隨著年齡的增長而逐漸累積，一旦有機(jī)會(huì)重新進(jìn)入細(xì)胞周期，將會(huì)誘發(fā)腫瘤的發(fā)生[14]。研究[15-17]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞衰老誘導(dǎo)的致癌機(jī)制可能與衰老細(xì)胞產(chǎn)生的一系列可溶性細(xì)胞因子相關(guān)，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)等，此類細(xì)胞因子免疫表型的改變可能通過上皮-間葉轉(zhuǎn)化使得腫瘤細(xì)胞的侵襲性顯著增強(qiáng)。鑒于此原因，未來臨床醫(yī)生除對腫瘤進(jìn)行放化療外，有望通過清除機(jī)體中的衰老細(xì)胞從而達(dá)到延緩或阻止腫瘤發(fā)生與發(fā)展的目的，同時(shí)也可延長患者的壽命。積累的衰老細(xì)胞若不能及時(shí)有效地加以清除，也將有可能成為細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的保護(hù)傘和屏障[18]。

綜上所述，K-ras誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老與胃癌發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞衰老誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的雙向作用給臨床腫瘤治療工作提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，科技工作者要充分探索不同腫瘤中細(xì)胞衰老的形成、維持和阻斷的分子機(jī)制，為抗腫瘤治療提供合理的策略。