宋香妮，陳瑤莉，楊 劍，穆金姬

(銅川市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 銅川 727000)

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人們的身心健康[1-3]。近年來(lái)科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、手術(shù)方法的改進(jìn)、免疫治療及新輔助化療的廣泛應(yīng)用大大提高了胃癌患者的預(yù)后，但是胃癌患者術(shù)后5年生存率仍然較低[4-7]。胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因[1]，因此了解胃癌發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)胃癌的治療及預(yù)后非常重要。卷曲蛋白8(Frizzled 8，F(xiàn)ZD8)是Wnt家族的受體之一，是一種7次跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)類(lèi)似于G蛋白偶聯(lián)型受體。FZD8參與體內(nèi)多種生理和病理過(guò)程，在人類(lèi)肺癌、口腔癌、急性淋巴細(xì)胞白血病、前列腺癌等多種腫瘤中參與細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)移[8-10]。Demirci等[11]使用qRT-PCR方法檢測(cè)到FZD8在胃癌組織中高表達(dá)，并與胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。但FZD8在胃癌中的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在檢測(cè)FZD8在人胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞中的表達(dá)水平，并通過(guò)沉默人胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞中的FZD8來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)BGC823細(xì)胞遷移和侵襲的影響，總結(jié)其潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人胃癌細(xì)胞BGC823細(xì)胞和人胃黏膜上皮細(xì)胞GES1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可收割用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑：Trizol試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；慢病毒(批號(hào)：JRR041B)購(gòu)自中國(guó)吉?jiǎng)P生物有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：DCR048A)購(gòu)自日本Takara公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)購(gòu)自康為世紀(jì)生物有限責(zé)任公司；兔抗人FZD8、β-actin抗體和羊抗兔熒光素標(biāo)記的IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó) BD Biosciences公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 用慢病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，建立穩(wěn)定的FZD8基因敲減細(xì)胞(shFZD8)[12]，采用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，并進(jìn)行Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA水平：用TrIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR循環(huán)擴(kuò)增，內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。GAPDH基因上游引物序列為5’-AGCDACTCCTCCACCTTTG-3’，下游引物序列為5’-CACAACCCTGTTGCTGTAT-3’。FZD8基因上游引物序列為5’-TCGCAGCCTCCGGGTG-3’，下游引物序列為5’-TGTCTGTGCTCATAGCCTGG-3’[13]。

1.2.2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：蛋白質(zhì)裂解緩沖液裂解提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。按照BCA蛋白定量試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行蛋白定量，并稀釋到相同濃度。各組蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合后，100 ℃下煮沸10 min，加入到配置好的10%和5% SDS-PAGE中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，100 V電壓濕轉(zhuǎn)1 h，切膠，蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗人FZD8抗體(1∶1000稀釋)和兔抗人β-actin抗體(1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，并用TBST清洗3次，每次10 min，羊抗兔熒光素標(biāo)記的IgG(1∶10000稀釋)室溫孵育1 h，TBST清洗3次。采用電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影，用Bio-Rad成像系統(tǒng)采集圖像并對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.2.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，PBS洗滌2次。用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后稀釋濃度至1×105/ml，用移液器給每孔加200 μl細(xì)胞懸液到Transwell小室的上室，下層小室加入0.5 ml 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出Transwell小室，PBS輕輕淋洗3遍，用棉簽輕輕拭去小室上室中的細(xì)胞，95%乙醇固定5 min，用滴管加入4 g/L結(jié)晶紫染色10 min。PBS輕輕淋洗3遍，顯微鏡下觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞并隨機(jī)取8個(gè)視野計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：將基質(zhì)膠和無(wú)血清培養(yǎng)基按照1∶8比例稀釋并混合，加入到Transwell小室中，每孔50 μl，于37 ℃培養(yǎng)箱中固化。其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BGC823和GES1細(xì)胞FZD8蛋白及mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖1。與GES1細(xì)胞相比，BGC823細(xì)胞FZD8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯增高(t=6.379、7.972，均P<0.01)，分別約為前者的2.8倍和2.4倍。

注：與BGC823細(xì)胞比較，*P<0.01

2.2 BGC823細(xì)胞FZD8基因沉默驗(yàn)證 見(jiàn)圖2。Western blot和PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組(未沉默F(xiàn)ZD8基因的BGC823細(xì)胞)，shFZD8組細(xì)胞中FZD8蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯降低(t=6.366、5.803，均P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.3 沉默F(xiàn)ZD8基因?qū)GC823細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 見(jiàn)圖3。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(110.7±12.4)個(gè)和(121.6±13.8)個(gè)，shFZD8組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(42.3±10.2)個(gè)和(56.4±9.6)個(gè)。與對(duì)照組相比，shFZD8組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(t=4.668、9.500，均P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

3 討 論

胃癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，內(nèi)鏡檢查的普及與早癌診療技術(shù)的開(kāi)展大大提高了早期胃癌患者的生存率，但胃癌早期癥狀并不典型，大多數(shù)胃癌患者被診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致中晚期胃癌具有較高的死亡率[14-15]。因此，探究胃癌早期病變指標(biāo)，探討胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，對(duì)改善胃癌患者預(yù)后尤為重要。

FZD8是Wnt家族的受體之一，為一種7次跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)類(lèi)似于G蛋白偶聯(lián)型受體。FZD8參與多種人體生理過(guò)程，如參與胚胎時(shí)期形態(tài)發(fā)生，維持原始造血干細(xì)胞靜息狀態(tài)下的功能[16-17]。同時(shí)，F(xiàn)ZD8在包括腫瘤、耐藥等病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9-10,17]。張煥新[12]研究發(fā)現(xiàn)FZD8在費(fèi)城染色體陽(yáng)性急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中表達(dá)，而在正常人外周單核細(xì)胞中并未發(fā)現(xiàn)FZD8表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FZD8通過(guò)非經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)白血病細(xì)胞對(duì)化療藥的耐藥。Yang等[8]報(bào)道FZD8在腎細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并通過(guò)非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)FZD8可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，并且通過(guò)激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。

FZD8也可以作為分子靶點(diǎn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Liu等[18]報(bào)道m(xù)iRNA-99b-5p通過(guò)直接作用FZD8激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。編碼轉(zhuǎn)錄因子基因ERG可以直接作用于FZD8，從而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。Demirci等[11]使用qRT-PCR方法檢測(cè)胃癌和癌旁組織中FZD8的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織中高表達(dá)，胃癌轉(zhuǎn)移組FZD8表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移組，提示FZD8可能是胃癌的新生標(biāo)志物。但FZD8的表達(dá)水平是否影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其機(jī)制尚不明確。

本研究首先檢測(cè)人胃癌BGC823細(xì)胞和人胃黏膜上皮GES1細(xì)胞FZD8表達(dá)水平，通過(guò)篩選出能夠穩(wěn)定敲減FZD8的BGC823 細(xì)胞株探討FZD8敲減對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。結(jié)果顯示，人胃癌BGC823細(xì)胞中FZD8 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于人胃黏膜上皮GES1細(xì)胞。沉默F(xiàn)ZD8的BGC823細(xì)胞中FZD8 mRNA及蛋白表達(dá)含量明顯低于對(duì)照組，提示敲減FZD8后的BGC823細(xì)胞可以穩(wěn)定地下調(diào)FZD8的表達(dá)，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示shFZD8組細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明沉默F(xiàn)ZD8基因能夠顯著抑制人胃癌BGC823細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，F(xiàn)ZD8在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲減人胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞中的FZD8可以抑制BGC823細(xì)胞的遷移和侵襲能力。FZD8作為促癌基因，對(duì)其結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)識(shí)有望為胃癌的防治及預(yù)后提供新思路。但是，本研究只是初步探索了FZD8在BGC823細(xì)胞中的作用，在后續(xù)的研究工作中，我們還需要完善其他生物學(xué)功能檢測(cè)(細(xì)胞周期、增殖、凋亡、耐藥等)，并且從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平探索FZD8在胃癌中的具體作用機(jī)制。