梁小弟，梁小菊，李芙蓉，石茂才

(1.定西市人民醫(yī)院骨科，甘肅 定西 743000；2.西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院小兒骨科，陜西 西安 710054；3.定西市人民醫(yī)院麻醉科，甘肅 定西 743000)

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種以年齡為主要誘因的退行性疾病，病理特點(diǎn)以關(guān)節(jié)軟骨的退變?yōu)橹鳎瑫r(shí)滑膜和軟骨下骨發(fā)生病變[1-3]。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎也是一種炎癥性疾病[4-5]。許多炎癥因子在疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，其中白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)促進(jìn)產(chǎn)生和釋放多種炎癥介質(zhì)和代謝因子，如一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞功能。因此，抑制IL-1β及其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是有效治療OA的策略[6-7]。生長(zhǎng)分化因子-15(Growth differentiation factor-15，GDF-15)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族中的應(yīng)激反應(yīng)成員之一，已被證實(shí)參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及分化等各種生物學(xué)進(jìn)程[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中GDF-15水平可以作為侵蝕破壞的潛在標(biāo)志。另外，GDF-15可以作為脊椎關(guān)節(jié)炎的鑒別標(biāo)志物[10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)GDF-15在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中的表達(dá)水平低于正常軟骨，然而GDF-15在OA發(fā)展中的具體作用仍是未知的。本研究探討GDF-15對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，以期為膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(Knee normal human articular chondrocytes,NHAC-kn)(CC-2550；美國(guó)LONZA公司)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中，置于含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37 ℃。

1.2 細(xì)胞活性檢測(cè) NHAC-kn細(xì)胞接種于96孔板，密度為5×103細(xì)胞/孔。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后，采用不同濃度的IL-1β(HEILP-0102；賽業(yè)生物)(1、5、10、15 ng/ml)處理軟骨細(xì)胞24 h，參照CCK-8試劑盒(南京凱基生物科技公司)說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000將GDF-15過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-GDF-15；GDF-15)和空載體質(zhì)粒(pcDNA3.1-NC；Vector)分別轉(zhuǎn)染到NHAC-kn細(xì)胞。24 h后，收集轉(zhuǎn)染的NHAC-kn細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。GDF-15過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建于武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室。

1.4 定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè) 使用上述的TRIzol試劑從軟骨細(xì)胞中提取總RNA。使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和cDNA合成試劑盒合成cDNA。RT-PCR采用qPCR定量試劑盒在ABI 7500 Real-time PCR儀上進(jìn)行。GAPDH作為內(nèi)參基因。采用2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測(cè) 利用RIPA緩沖液提取總蛋白，然后使用BCA(美國(guó)Thermo Scientific公司)對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。取40 ng蛋白于10% SDS-PAGE凝膠電泳上進(jìn)行分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉3 h后，用iNOS、COX-2、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶B(AKT)和p-p65、p65、NADPH的一抗4 ℃孵育過(guò)夜。隨后，在室溫下用HRP結(jié)合的二抗(南京鐘鼎生物公司)和ECL檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 ELISA檢測(cè) 處理或未處理的軟骨細(xì)胞均勻接種于24孔板，密度為1×105細(xì)胞/孔，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。分別使用半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性測(cè)定試劑盒及NO、PGE2、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 處理或未處理的軟骨細(xì)胞均勻接種于24孔板，密度為1×105細(xì)胞/孔，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。使用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 IL-1β對(duì)GDF-15 mRNA表達(dá)水平和NHAC-kn細(xì)胞活性的影響 不同濃度IL-1β(1、5、10、15 ng/ml)處理NHAC-kn細(xì)胞24 h以模擬OA的細(xì)胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(未處理)相比，IL-1β處理軟骨細(xì)胞后GDF-15 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，且IL-1β濃度越高，GDF-15 mRNA表達(dá)水平越低，見(jiàn)圖1A。另外，IL-1β處理軟骨細(xì)胞后，細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

注：與對(duì)照組(Control)比較，*P<0.05

2.2 GDF-15過(guò)表達(dá)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的NHAC-kn細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性的影響 為了探究GDF-15在IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中的作用，我們將GDF-15過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至NHAC-kn細(xì)胞。將NHAC-kn細(xì)胞分為未處理組、IL-1β組(10 ng/ml)、IL-1β(10 ng/ml)+Vector(pcDNA3.1-NC)組、IL-1β(10 ng/ml)+GDF-15(pcDNA3.1-GDF-15)組，培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，與IL-1β+Vector組相比，IL-1β+GDF-15組GDF-15 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2A。另外，IL-1β處理顯著提高了軟骨細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性，而GDF-15過(guò)表達(dá)緩解了IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和Caspase-3活性升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖2B、C。

注：與對(duì)照組(Control)比較，*P<0.05；與IL-1β+Vector組比較，#P<0.05

2.3 GDF-15過(guò)表達(dá)對(duì)NHAC-kn細(xì)胞NO、PGE2以及i-NOS和COX-2蛋白的影響 將NHAC-kn細(xì)胞分為未處理組、IL-1β組(10 ng/ml)、IL-1β(10 ng/ml)+Vector(pcDNA3.1-NC)組、IL-1β(10 ng/ml)+GDF-15(pcDNA3.1-GDF-15)，培養(yǎng)24 h。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與IL-1β+Vector組相比，IL-1β+GDF-15組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO和PGE2含量均顯著降低(均P<0.05)，見(jiàn)圖3A、B。同樣，過(guò)表達(dá)GDF-15抑制了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖3C、D。

注：與對(duì)照組(Control)比較，*P<0.05；與IL-1β+Vector組比較，#P<0.05

2.4 GDF-15過(guò)表達(dá)對(duì)NHAC-kn細(xì)胞中及上清液中IL-6和TNF-α的影響 見(jiàn)圖4。IL-1β處理后顯著提高了軟骨細(xì)胞中IL-6和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平以及上清液中IL-6和TNF-α含量，而過(guò)表達(dá)GDF-15緩解了由IL-1β引起的細(xì)胞促炎因子水平上調(diào)(均P<0.05)。

注：與對(duì)照組(Control)比較，*P<0.05；與IL-1β+Vector組比較，#P<0.05

2.5 GDF-15過(guò)表達(dá)通過(guò)PI3K/AKT/NF-κB通路抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng) Western blot結(jié)果顯示，IL-1β抑制AKT磷酸化水平，促進(jìn)p65磷酸化，而過(guò)表達(dá)GDF-15逆轉(zhuǎn)這種影響(P<0.05)，見(jiàn)圖5A-C。隨后，我們檢測(cè)了PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路和GDF-15在IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的關(guān)系，結(jié)果顯示MK-2206(PI3K/AKT信號(hào)通路特異性抑制劑)顯著抑制了GDF-15過(guò)表達(dá)對(duì)IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用(P<0.05)，見(jiàn)圖5D-F。

注：與IL-1β+Vector組比較，*P<0.05；與IL-1β+GDF-15組比較，#P<0.05

3 討 論

軟骨細(xì)胞是軟骨中唯一的細(xì)胞類型，一旦細(xì)胞凋亡被觸發(fā)，軟骨細(xì)胞很少能恢復(fù)[12]。軟骨細(xì)胞凋亡是OA發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。研究[13]表明，GDF-15具有抗凋亡作用。Heger等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-15在心力衰竭發(fā)展過(guò)程中被誘導(dǎo)，以減少心室心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肥厚性生長(zhǎng)。另外，血清中GDF-15的增加降低了口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中Caspase-3、7的活性。本研究探究了GDF-15在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷中的作用和機(jī)制，發(fā)現(xiàn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞可顯著下調(diào)GDF-15轉(zhuǎn)錄水平，而GDF-15過(guò)表達(dá)明顯抑制IL-1β的促凋亡作用，減少IL-1β誘導(dǎo)的Caspase-3活性。這些結(jié)果在一定程度上說(shuō)明GDF-15可以通過(guò)抑制凋亡來(lái)減弱IL-1β造成的軟骨損傷。

已有研究表明，炎癥細(xì)胞因子參與了OA的病理進(jìn)展。作為一個(gè)關(guān)鍵炎癥因子，IL-1β被廣泛用于模擬OA微環(huán)境的體外研究[15]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β刺激軟骨細(xì)胞增加了軟骨細(xì)胞上清液中NO和PGE2含量以及軟骨細(xì)胞中iNOS和COX-2表達(dá)，說(shuō)明IL-1β可以在體外模擬OA微環(huán)境。作為一氧化氮合酶(NOS)家族中的一員，iNOS能夠合成炎癥介質(zhì)NO。同樣，COX-2作為OA疼痛和炎癥的重要介質(zhì)，可以產(chǎn)生另一種炎癥介質(zhì)——PGE2[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)OA患者中，NO和PGE2水平明顯升高，抑制其表達(dá)可以顯著延緩OA的病理過(guò)程。研究[18]表明，在急性肺損傷的小鼠中，過(guò)表達(dá)GDF-15可以抑制肝組織和血清中IL-6和TNF-α的含量以及iNOS的表達(dá)。本研究中，GDF-15過(guò)表達(dá)顯著抑制了IL-1β誘導(dǎo)的NO和PGE2含量及iNOS和COX-2蛋白表達(dá)，以及細(xì)胞炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平，說(shuō)明GDF-15可以通過(guò)減輕炎癥對(duì)OA起到治療作用。

研究[19]證明，IL-1β的促炎和促凋亡作用是由于激活了多個(gè)信號(hào)通路，包括p38、JNK、Wnt/β-catenin及NF-κB等，其中最重要的是NF-κB信號(hào)通路。已有文獻(xiàn)表明，NF-κB信號(hào)通路在OA中被激活，且在OA的發(fā)病機(jī)制中扮演著至關(guān)重要的角色。NF-κB信號(hào)通路的激活會(huì)誘發(fā)一些炎癥介質(zhì)如NO、COX-2趨化因子的表達(dá)。因此，NF-κB信號(hào)通路被認(rèn)為是治療OA的一個(gè)潛在的治療靶標(biāo)[20]。實(shí)際上，在OA的動(dòng)物和細(xì)胞模型中已經(jīng)證明一些NF-κB藥理抑制劑具有保護(hù)特性[21]。PI3K/AKT信號(hào)是NF-κB信號(hào)通路上游的一個(gè)主要元素，通過(guò)抑制其活動(dòng)，NF-κB磷酸化可以明顯減少[22]。還有研究[18,23]發(fā)現(xiàn)，GDF-15可激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制NF-κB活性。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)GDF-15促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的AKT磷酸化且抑制軟骨細(xì)胞凋亡以及炎癥因子、p-p65表達(dá)。另外，MK-2206(PI3K/AKT信號(hào)通路的特異性抑制劑)減少了過(guò)表達(dá)GDF-15在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷中的修復(fù)作用。這些結(jié)果均表明GDF-15可能通過(guò)激活PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而緩解IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，GDF-15作用于PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路，可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減少OA軟骨損傷。因此，GDF-15可能是治療OA的重要靶標(biāo)。