韓艷珍，單鐵英，李 偉，劉海平，安曉紅，康瑞靜，儲(chǔ) 媛

(1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，河北 邯鄲 056002；2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056002；3.邯鄲市中心醫(yī)院護(hù)理科，河北 邯鄲 056002；4.邯鄲市雞澤縣醫(yī)院，河北 雞澤 057350；5.五礦邯邢職工總醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

肝纖維化是炎癥因子等有害因子長(zhǎng)期作用于肝臟組織，使肝臟組織結(jié)構(gòu)反應(yīng)性地出現(xiàn)的一種病理改變。其典型的病變特點(diǎn)為肝組織中有細(xì)胞壞死、組織反應(yīng)性增生。如果此種病變的進(jìn)程沒(méi)有得到及時(shí)阻止，肝組織的損傷范圍會(huì)擴(kuò)大，程度會(huì)加重，肝臟的質(zhì)地變硬造成肝硬化，再繼續(xù)發(fā)展肝組織會(huì)癌變，此時(shí)即使采取治療措施也將不會(huì)逆轉(zhuǎn)，病情嚴(yán)重并且危險(xiǎn)性高。因此，尋找能夠及時(shí)有效地阻止、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物成為了關(guān)鍵所在。目前臨床上干預(yù)肝纖維化的藥物大多數(shù)為西藥，就價(jià)格和所帶來(lái)的不良反應(yīng)來(lái)說(shuō)，它們的使用人群沒(méi)有得到較大范圍的普及。近年來(lái)，中草藥的應(yīng)用得到了人們的重視，它具有不良反應(yīng)小、取材途徑較多等優(yōu)點(diǎn)。枸杞為較常見(jiàn)的中草藥，枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)為其組成成分里的一種?，F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)LBP對(duì)機(jī)體的功效頗多，如增強(qiáng)免疫細(xì)胞效能、減少氧化應(yīng)激的損傷、有效抗擊癌細(xì)胞的存活等[1-3]。關(guān)于LBP干預(yù)肝纖維化的效果及機(jī)制目前尚不清楚，本研究通過(guò)結(jié)扎小鼠膽總管使其肝組織發(fā)生纖維化，觀察LBP干預(yù)后的效果并總結(jié)其機(jī)制，為阻止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化探索新的防治策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物來(lái)源：18只雄性57BL-6小鼠由河北醫(yī)科大學(xué)組胚教研室贈(zèng)送，平均周齡(5.00±1.36)周，平均體重(0.32±0.28)kg。許可證號(hào)：SCXK(冀)2019-2-011。

1.1.2 主要試劑：枸杞多糖[衛(wèi)食健字(2000)第0034，武漢廣夏枸杞開(kāi)發(fā)有限公司]，口服時(shí)用三蒸水溶解調(diào)制?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)第一抗體(批號(hào)：CD-109273GM)由武漢純度生物科技有限公司提供。羥脯氨酸試劑盒(批號(hào)：FT-T2774)由上海梵態(tài)生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立肝纖維化病變模型及分組：選12只小鼠從腹中線剪開(kāi)，無(wú)菌環(huán)境中分離并結(jié)扎膽總管，造成小鼠肝組織發(fā)生纖維化病變，然后平均分配入2籠，分別為肝纖維化組和LBP組，再選1籠正常小鼠(6只)為對(duì)照組。LBP組服用含LBP 25 μg/L的三蒸水200 ml，對(duì)照組和肝纖維化組僅服用三蒸水200 ml，1次/d，連續(xù)服用30 d。第31天抽取各組小鼠的腹主動(dòng)脈血液，經(jīng)過(guò)離心得到血清后冷藏待檢測(cè)。

1.2.2 肝功能指標(biāo)檢測(cè)：將各組小鼠的血清放入生物化學(xué)儀器中分析谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平。

1.2.3 肝組織切片制備并HE染色：干預(yù)完畢后切取約1 cm×1 cm×1 cm肝臟組織塊，浸沒(méi)到甲醛液體中以保存其生活狀態(tài)結(jié)構(gòu)，用酒精置換出組織塊中的水分，用二甲苯溶液增強(qiáng)其透光性，再投入石蠟溶液中，冷卻后上機(jī)切割為5 μm薄片，鋪展于載玻片上，晾干。先將粘有組織薄片的載玻片依次浸入二甲苯液、乙醇濃度逐漸降低的溶液中，然后浸入蒸餾水中，最后浸入堿性蘇木精、酸性伊紅里上色，鋪上蓋玻片，晾干。

1.2.4 MMP-2和TIMP-2 Western blot檢測(cè)：將每組小鼠的肝組織研為漿液，分離漿液中的蛋白質(zhì)，取出少量的蛋白質(zhì)按照說(shuō)明書(shū)的步驟依次經(jīng)過(guò)變性、加入濃縮膠中、放入電泳槽中電泳、分離膠塊、將膠塊中的蛋白條帶轉(zhuǎn)入膜中。膜封閉后，先后用MMP-2和TIMP-2的一抗液、有標(biāo)記的二抗液孵育，膜清洗后放入暗室中顯影于X線片上并定影，采用圖像軟件分析其灰度值并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)內(nèi)參]。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)比較 見(jiàn)圖1。正常組肝臟里的每個(gè)小葉結(jié)構(gòu)分界清楚，其中央為中央靜脈。肝纖維化組肝臟中有輕重程度不一、面積大小不同的組織壞死，小葉輪廓不清，只見(jiàn)結(jié)締組織范圍擴(kuò)大，內(nèi)含數(shù)量較多的小葉間膽管。LBP組肝組織壞死程度減輕，壞死面積也有所減小，結(jié)締組織范圍縮小，其內(nèi)的小葉間膽管數(shù)目變少。

A:正常組 B：肝纖維化組 C:LBP組

2.2 三組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平比較 見(jiàn)表1。與正常組比較，肝纖維化組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均升高(均P<0.05)。與肝纖維化組比較，LBP組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均下降(均P<0.05)。

表1 三組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平比較(U/L)

2.3 三組小鼠MMP-2、TIMP-2相對(duì)表達(dá)量及MMP-2/TIMP-2比較 見(jiàn)表2(圖2)。與正常組相比較，肝纖維化組MMP-2的相對(duì)表達(dá)量略微上升(P>0.05)，TIMP-2的相對(duì)表達(dá)量升高明顯(P<0.05)，MMP-2/TIMP-2下降(P<0.05)。與肝纖維化組比較，LBP組MMP-2相對(duì)表達(dá)量升高，TIMP-2相對(duì)表達(dá)量下降，MMP-2/TIMP-2上升(均P<0.05)。

表2 三組小鼠MMP-2、TIMP-2相對(duì)表達(dá)量及MMP-2/TIMP-2比較

圖2 三組小鼠MMP-2與TIMP-2 Western blot檢測(cè)

3 討 論

枸杞子屬于一種茄科植物，早已被中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)列為具有滋補(bǔ)功效的中草藥，現(xiàn)已被廣大人群用作滋補(bǔ)保健品。LBP是其成分中的一種水溶性物質(zhì)，不僅含有多種單糖，而且還含有其他的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4]。研究[5-8]表明，LBP具有提高機(jī)體中免疫細(xì)胞活性、削弱氧化應(yīng)激造成的組織損傷、拮抗惡性腫瘤細(xì)胞在機(jī)體中的生存、通過(guò)降低炎癥反應(yīng)部位的生物學(xué)因子活性或數(shù)量來(lái)阻止損傷作用等多種生物學(xué)功效。肝臟纖維化病變的發(fā)生、發(fā)展與炎癥因子的長(zhǎng)期不良作用密切相關(guān)[9]，因此本研究觀察LBP對(duì)肝纖維化損傷是否具有改善作用，并探究其作用機(jī)制。

本研究通過(guò)結(jié)扎膽總管使膽汁通路受阻，導(dǎo)致肝臟組織出現(xiàn)纖維化病變。因?yàn)楦渭?xì)胞產(chǎn)生的膽汁逐漸增多并淤積在結(jié)扎以上的肝臟中大小不同的膽管里，肝臟期初會(huì)反應(yīng)性地通過(guò)擴(kuò)大膽管管腔和增加其數(shù)量來(lái)緩解病情的進(jìn)展，但是這種緩解能力有限，膽汁的繼續(xù)增多會(huì)沖破膽管流入至肝組織中，壓迫組織中的營(yíng)養(yǎng)血管，使其不能為肝細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞缺血、壞死，血液里的炎性細(xì)胞會(huì)游走到壞死組織中，壞死部位周圍的結(jié)締組織會(huì)反應(yīng)性增生，造成肝組織結(jié)構(gòu)紊亂不清。此種依靠膽汁通路不暢引起的小鼠肝纖維化病變的實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，模型制作的合格率較高[10]。

肝組織由肝細(xì)胞缺血、壞死到組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)肝組織中細(xì)胞外間質(zhì)成分增生且含量增多，其中數(shù)量顯著增多的是間質(zhì)中的膠原纖維。健康的肝組織中膠原纖維的分泌與分解保持著平衡穩(wěn)態(tài)，此種穩(wěn)態(tài)主要通過(guò)兩種相互拮抗的酶——MMP和TIMP的水平來(lái)決定，兩者比值的升高或者降低對(duì)間質(zhì)含量起著關(guān)鍵性的作用[11-13]。引起肝纖維化病變的關(guān)鍵是肝星狀細(xì)胞的數(shù)量和活性增加。動(dòng)物研究[14-15]證明，肝纖維化組織中MMP-2的含量上升，MMP-2可以分解Ⅳ型膠原等間質(zhì)成分，破壞肝血竇的基底膜結(jié)構(gòu)，也可增加肝星狀細(xì)胞的活性，加重肝纖維化的病情。TIMP-2為MMP-2的拮抗劑，可以和MMP-2特異性結(jié)合而降低其活性。

本研究結(jié)果表明，正常肝臟里MMP-2和TIMP-2含量均較少，當(dāng)肝發(fā)生纖維化病變時(shí)MMP-2含量略微增加，而TIMP-2含量增加較明顯，MMP-2/TIMP-2降低。與肝纖維化組比較，LBP組肝臟內(nèi)的MMP-2含量明顯增加，TIMP-2含量明顯減少，且兩者比值明顯升高。從這些數(shù)據(jù)可以看出，衡量肝纖維化病程進(jìn)展不能僅依賴MMP-2或者TIMP-2含量，而是要看兩者比值。在肝纖維化時(shí)，MMP-2/TIMP-2降低，可以說(shuō)明雖然兩者含量均升高，但TIMP-2升高幅度高于MMP-2，造成間質(zhì)含量增加而纖維化加重。服用LBP后，MMP-2含量繼續(xù)增加而TIMP-2含量有所減少，MMP-2/TIMP-2升高，此時(shí)MMP-2的作用才能顯現(xiàn)出來(lái)，使間質(zhì)成分降解，減輕纖維化以保護(hù)肝組織。