李雪穎，李 靜，張紅梅，周 蓉

(陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068)

缺血再灌注損傷是在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官損傷反而加重的現(xiàn)象[1]，是眼科常見的病理過程，常見于青光眼急性大發(fā)作降眼壓治療過程、視網(wǎng)膜血管栓塞性疾病的溶栓治療過程以及影響視網(wǎng)膜血流的各種眼科手術(shù)過程中[2]。視網(wǎng)膜缺血后再灌注可引起視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞壞死、凋亡，視網(wǎng)膜萎縮變薄[3]，也可以使Müller細胞過度活化[4]、小膠質(zhì)細胞活化以及大量炎性因子生成[5]，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]，從而造成視網(wǎng)膜損傷，導(dǎo)致嚴重的視覺障礙。視網(wǎng)膜缺血再灌注(Retinal ischemia-reperfusion，RIR)損傷指缺血性眼病患者的視網(wǎng)膜在恢復(fù)供血后出現(xiàn)明顯的功能障礙，甚至發(fā)生不可逆性損傷，再灌注并不緩解視網(wǎng)膜細胞的損傷，反而加劇了細胞的死亡[7]。目前對于視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的治療主要為輔助的藥物治療，細胞移植治療方法經(jīng)過多年研究還是處于實驗室探索階段。本研究擬通過觀察模型大鼠視網(wǎng)膜前體細胞(Retinal progenitor cells，RPCs)移植后缺血再灌注損傷視網(wǎng)膜形態(tài)的改變，為新臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級2月齡雄性SD大鼠，體重200～250 g，無眼疾，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)保持12 h晝夜交替的生物節(jié)律，室溫保持在20～24 ℃，每日定時清洗籠舍。實驗動物能自由飲用水和食物。將56只SD大鼠隨機分為對照組(未做任何處理)、假手術(shù)組(只做前房穿刺，sham組)、前房灌注模型組(RIR組)、視網(wǎng)膜前體細胞視網(wǎng)膜下腔移植組(前房灌注后視網(wǎng)膜下腔移植視網(wǎng)膜前體細胞，RIR+R-C組)、PBS視網(wǎng)膜下腔移植組(前房灌注后視網(wǎng)膜下腔移植PBS，RIR+R-PBS組)、視網(wǎng)膜前體細胞上丘移植組(前房灌注后上丘移植視網(wǎng)膜前體細胞，RIR+SC-C組)與PBS上丘移植組(前房灌注后上丘移植PBS，RIR+SC-PBS組)，每組8只。

1.2 主要試劑 兔抗大鼠Thy-1多克隆抗體(批號：sc-9163；Santa cruz biotechnology公司)；兔抗大鼠PKC多克隆抗(批號：ab71558；Abcam公司)；小鼠抗大鼠視紫紅質(zhì)多克隆抗體(批號：ab190307；Abcam公司)；Cy3標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG；5%山羊血清；Triton X-100；甘油。

1.3 主要儀器 熒光顯微鏡(日本Olympus DP71)；Ts-2型脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；電生理儀(德國羅蘭公司)；SAE-200電子天平(德國Heraeus公司)；鼠用立體定位儀；5 μl微量注射器；微型電鉆。

1.4 細胞分離培養(yǎng) ①無菌條件下，斷頭處死新生大鼠，取頭部浸泡在盛有0.1 mol/L PBS的培養(yǎng)皿中，0.1 mol/L PBS沖洗2遍。②分離出眼球，放入含少量DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。③解剖顯微鏡下去除眼球外結(jié)締組織。④沿角鞏膜緣剪去角膜，用虹膜恢復(fù)器及鑷子小心去除晶狀體和玻璃體。⑤視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮與色素上皮層可在操作過程中自動剝離。使用虹膜恢復(fù)器仔細剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，置于含少量完全培養(yǎng)基的小平皿內(nèi)。用小剪刀將視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層盡量剪碎成勻漿，加入少量完全培養(yǎng)基，用玻璃吸管吹打40～60次后過200目篩網(wǎng)，制成單細胞懸液。⑥用小剪刀將視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層盡量剪碎成勻漿，加入少量完全培養(yǎng)基，用玻璃吸管吹打40～60次，過200目篩網(wǎng)，制成單細胞懸液。⑦臺盼藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，接種細胞懸液于培養(yǎng)瓶。于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)，隔天加1～2 ml完全培養(yǎng)基。⑧培養(yǎng)7 d后傳代。使用玻璃吸管將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)瓶2次，將洗滌液移入離心管，1200 r/min離心5 min，棄上液后加入1 ml消化液，37 ℃孵育5 min后使用玻璃吸管吹打40次左右，再次1200 r/min離心5 min后棄上液，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照2×105/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.5 腺相關(guān)病毒8(Adeno-associated virus8，AAV-8)轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜前體細胞 傳代后將視網(wǎng)膜前體細胞以1×105/ml的密度接種于含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，以1∶100的比例加入相應(yīng)的AAV-8病毒液，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)72 h后收集轉(zhuǎn)染的細胞，用0.01 mol/L PBS洗2次。將細胞以1×104/ml的密度接種于含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵育箱中培養(yǎng)7 d。

1.6 大鼠RIR損傷動物模型制作 大鼠稱重后，給予10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉后，將大鼠固定在自制載物板上。左眼局部消毒，生理鹽水與氧氟沙星眼藥水清潔結(jié)膜囊。將4.5號頭皮針自大鼠顳側(cè)角膜緣穿刺入眼前房進行灌注，注意勿傷及虹膜和晶狀體。膠布固定穿刺針頭于定位儀上，接通預(yù)先連接好的生理鹽水輸液瓶，將輸液瓶高度升高到150 cm，壓力為150 cmH2O。觀察可見球結(jié)膜蒼白，虹膜迅速變白，生理鹽水保持角膜濕潤。持續(xù)前房灌注加壓造成視網(wǎng)膜缺血60 min后，緩慢降壓至正常水平，拔出穿刺針頭，虹膜及球結(jié)膜顏色迅速恢復(fù)正常，結(jié)膜囊滴氧氟沙星眼藥水預(yù)防感染。松解大鼠，讓其自行蘇醒。對照組不做任何處理。

1.7 視網(wǎng)膜下腔細胞移植 將大鼠固定在自制載物板上，使術(shù)眼朝向正上方。常規(guī)表面麻醉、鋪巾，在2點鐘方位用顯微有齒鑷提起球結(jié)膜及其下筋膜，再用顯微剪打開一小缺口，鈍性分離球結(jié)膜及其下筋膜，暴露鞏膜；在角鞏緣后3 mm做淺層鞏膜切口(不全切透)。用5 μl顯微注射器抽取1 μl視網(wǎng)膜前體細胞懸液，將30G針頭從切口處插入視網(wǎng)膜下腔，緩緩注入1 μl視網(wǎng)膜前體細胞懸液，針頭在原地停留30 s后緩緩拔出，用棉簽按壓片刻以防止細胞懸液外漏。術(shù)后給予抗生素眼液滴眼。

1.8 上丘細胞移植 在立體定位儀上俯臥位固定麻醉后的模型大鼠。剪掉大鼠頭頂部毛發(fā)，碘伏消毒后矢狀位剪開頭皮(切口長約1 cm)，去掉頭皮下疏松結(jié)締組織后用2% H2O2棉簽涂擦顱骨外膜數(shù)秒，然后用吸耳球?qū)χB骨外膜反復(fù)吹吸至前囟暴露清楚(約在兩側(cè)外眥連線中點處)，用簽字筆在該處做一標記。以前囟為原點，在立體定位儀上移動微量注射器向右1.5 mm，向后6 mm，在針尖相對處的顱骨表面再做一標記，用微型電鉆在該處鉆開顱骨，深度至硬腦膜表面。用微量注射器吸取1 μl視網(wǎng)膜前體細胞懸液，向下移動微量注射器使針尖貼在硬腦膜表面。再次確認微量注射器針尖貼在硬腦膜表面后，開始緩慢下降微量注射器，距硬腦膜下6 mm 為注射點(右旁開1.5 mm，前囟后6 mm，硬腦膜下6 mm)。緩慢注射1 μl細胞懸液，留針10 min 后緩慢退針。生理鹽水沖洗切口，紅霉素軟膏封閉顱骨鉆孔，常規(guī)縫皮、消毒。

1.9 取材與觀察方法 灌注后取左眼做冰凍切片。連續(xù)切片從顳側(cè)開始，冰凍切片厚度為12 μm。不同眼球選擇相同切面通過免疫熒光染色進行比較，染色后熒光顯微鏡下進行觀察與拍照。每個標本選3張切片，每個切片選2個視野，測量標本距離視盤相對一致部位的視網(wǎng)膜厚度。

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜前體細胞視網(wǎng)膜下腔移植后在大鼠體內(nèi)存活、遷徙與分化情況 見圖1A-D。RIR成年SD大鼠視網(wǎng)膜下腔視網(wǎng)膜前體細胞移植術(shù)后8周，可在大鼠視網(wǎng)膜的外核層觀察到表達綠色熒光的細胞；細胞遷移整合到外核層并可表達視桿細胞標識物視紫紅質(zhì)。內(nèi)核層與神經(jīng)節(jié)細胞層未發(fā)現(xiàn)表達綠色熒光的細胞。

2.2 視網(wǎng)膜前體細胞上丘移植后在大鼠體內(nèi)存活、遷徙與分化情況 見圖1E-H。RIR成年SD大鼠上丘視網(wǎng)膜前體細胞移植術(shù)后8周，可在移植部位觀察到表達綠色熒光細胞，未發(fā)現(xiàn)移植細胞表達成熟視網(wǎng)膜細胞的特異性標志物視紫紅質(zhì)，視網(wǎng)膜各層均未發(fā)現(xiàn)表達綠色熒光細胞。

A、E：視紫紅質(zhì)；B、F：DAPI標記的細胞核；C、G：綠色熒光蛋白標記的視網(wǎng)膜前體細胞(箭頭)；D、H：對照組

2.3 視網(wǎng)膜前體細胞移植后大鼠視網(wǎng)膜厚度變化 見圖2。RIR成年SD大鼠視網(wǎng)膜下腔與上丘視網(wǎng)膜前體細胞移植術(shù)后8周，RIR組視網(wǎng)膜厚度與對照組、sham組比較均顯著降低(均P<0.001)，與RIR+SC-PBS組、RIR+R-PBS組比較均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)；sham組視網(wǎng)膜厚度與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；RIR+SC-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR組、RIR+SC-PBS組比較均顯著增加(均P<0.001)；RIR+R-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR組、RIR+R-PBS組、RIR+SC-C組比較均顯著增加(均P<0.001)。

注：***P<0.001

3 討 論

上丘是大鼠視網(wǎng)膜初級投射區(qū)域，大鼠視網(wǎng)膜損傷與上丘聯(lián)系密切，而視網(wǎng)膜下腔對于移植相對豁免，因此我們的實驗選擇視網(wǎng)膜下腔、上丘兩個部位作為移植部位，觀察視覺中樞移植與視網(wǎng)膜下腔移植對于缺血再灌注損傷視網(wǎng)膜的影響。Maclaren等[8]研究發(fā)現(xiàn)，移植的前體細胞能夠整合到宿主視網(wǎng)膜并產(chǎn)生突觸聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)的第一代視網(wǎng)膜前體細胞移植到視網(wǎng)膜下腔后，這些供體細胞整合進宿主視網(wǎng)膜外層，表達視桿細胞標志物視紫紅質(zhì)，沒有發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜前體細胞遷移到神經(jīng)節(jié)細胞層或表達神經(jīng)節(jié)細胞的標志物，這與既往研究結(jié)果是一致的，移植的細胞很難分化為神經(jīng)節(jié)細胞樣神經(jīng)元[9]。

本研究中，培養(yǎng)的第一代視網(wǎng)膜前體細胞移植到上丘后，視網(wǎng)膜前體細胞能夠在上丘中存活至少8周，但是未發(fā)現(xiàn)移植細胞遷移到視網(wǎng)膜，這可能與觀察時間長短以及視網(wǎng)膜切片的觀察范圍有關(guān)。近年研究[10]發(fā)現(xiàn)，通過激活代謝途徑能夠促進視網(wǎng)膜前體細胞的神經(jīng)分化，促進視網(wǎng)膜前體細胞對損傷的修復(fù)。Chang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)細胞的分化可以被神經(jīng)因子調(diào)控，促進干細胞分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。Freude等[11]研究發(fā)現(xiàn)將人類誘導(dǎo)的多能干細胞通過磁激活細胞分離方法可以分離出Müller祖細胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的祖細胞，這些特定類型細胞的移植可能更好地修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜節(jié)細胞。后續(xù)研究也可以借助一些其他方法或途徑來幫助視網(wǎng)膜前體細胞在移植體內(nèi)遷徙與分化，達到更好的修復(fù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜前體細胞移植到視網(wǎng)膜下腔8周后，RIR+R-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR+R-PBS、RIR+SC-C組比較均顯著增加，說明視網(wǎng)膜前體細胞視網(wǎng)膜下腔移植能夠保護視網(wǎng)膜細胞，減少視網(wǎng)膜細胞的損傷。這樣的保護作用可能與干細胞能夠產(chǎn)生生長因子有關(guān)。研究[12]發(fā)現(xiàn)干細胞在體內(nèi)外均可以產(chǎn)生生長因子如睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維細胞生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，對視網(wǎng)膜損傷具有保護作用。生長因子可以通過多種途徑參與干細胞的神經(jīng)分化，影響細胞的移植率[13]。視網(wǎng)膜前體細胞移植8周后，RIR+R-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR+SC-C組比較顯著增加，可能與移植細胞分泌的營養(yǎng)因子有關(guān)，視網(wǎng)膜下腔移植細胞更靠近損傷的視網(wǎng)膜，移植細胞分泌的營養(yǎng)因子能夠更早、更多地到達損傷的視網(wǎng)膜，保護視網(wǎng)膜細胞，誘導(dǎo)干細胞分化，維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。

視網(wǎng)膜前體細胞移植到上丘8周后，RIR+SC-C組視網(wǎng)膜厚度與RIR+SC-PBS組比較顯著增加，說明視網(wǎng)膜前體細胞上丘移植能夠保護視網(wǎng)膜細胞，減少視網(wǎng)膜細胞的損傷。研究[14]發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜損傷能夠誘導(dǎo)視網(wǎng)膜和腦相應(yīng)區(qū)域早期和遲發(fā)的損傷。也有研究[15]發(fā)現(xiàn)，大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后3 d，可以發(fā)現(xiàn)對側(cè)外側(cè)膝狀體背側(cè)核和上丘神經(jīng)元橫截面積減少，膠質(zhì)細胞激活。視網(wǎng)膜損傷后對側(cè)外側(cè)膝狀體背側(cè)核和上丘中BDNF與神經(jīng)生長因子表達增加。

本研究中雖然移植后在損傷的視網(wǎng)膜未觀察到移植細胞，但移植細胞在上丘一直存活，推測存活的移植細胞可能持續(xù)分泌一些細胞因子，而細胞因子通過特殊方式作用于損傷的視網(wǎng)膜，對視網(wǎng)膜起到保護作用。