黎軍宏，龍富立，黃晶晶，馬曉聰，張永琴

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第三大惡性腫瘤致死疾病，目前居于惡性腫瘤發(fā)病率的第五位［1］。適合行根治性手術(shù)切除的早期肝癌患者約占肝癌總?cè)藬?shù)的30%，多數(shù)患者確診時(shí)已出現(xiàn)不同程度的腫瘤細(xì)胞肝內(nèi)播散或者肝外遷移［2］。腫瘤的侵襲和遷移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者治療失敗、預(yù)后較差的主要原因［3］，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，超過90%導(dǎo)致實(shí)體腫瘤患者死亡的原因是由腫瘤的遠(yuǎn)處遷移引起，而不是由原發(fā)腫瘤所引起［4］。腫瘤細(xì)胞通過自身變化獲取一定的活動(dòng)遷移能力，然后侵襲穿過所在位置的細(xì)胞外基質(zhì)及間質(zhì)，進(jìn)一步侵襲進(jìn)入脈管系統(tǒng)，在脈管系統(tǒng)中持續(xù)存活，然后達(dá)到遠(yuǎn)處組織和生長(zhǎng)［5-6］。對(duì)于腫瘤細(xì)胞來說，通過其自身內(nèi)在的改變以及周圍環(huán)境的影響，使之適應(yīng)周圍環(huán)境并逐漸脫離細(xì)胞間接觸以及細(xì)胞與外周基質(zhì)、基底膜間的接觸，獲取一定的遷移能力，并最終侵襲入周圍間質(zhì)，是腫瘤發(fā)生遷移的關(guān)鍵起始步驟［7-8］。神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育下調(diào)因子9（neural precursor cell expressed developmentally down-regulat?ed 9，NEDD9）是一種與細(xì)胞表面粗附斑相關(guān)的細(xì)胞支架蛋白，其與HCC的侵襲和遷移關(guān)系密切［9］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NEDD9在肝癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，基因轉(zhuǎn)染上調(diào)NEDD9表達(dá)后肝癌細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲能力明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染下調(diào)NEDD9基因表達(dá)后這些能力相應(yīng)減弱；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)NEDD9與肝癌細(xì)胞的體內(nèi)增殖、遷移以及侵襲能力相關(guān)［10］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)扶陽保元方對(duì)多種實(shí)體瘤包括肝癌、肺癌等具有治療作用，本實(shí)驗(yàn)研究扶陽保元方通過調(diào)控NEDD9/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）信號(hào)抑制人肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用機(jī)制，為扶陽保元方治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人肝癌QGY-7701細(xì)胞株購(gòu)自通派生物科技有限公司，批號(hào)：907041。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠8只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK桂2014-0003。飼養(yǎng)條件：溫度25℃，濕度40%，12 h光照/12 h黑暗，隨意攝取水和食物。

1.3藥品與試劑 鹽酸吉西他濱（齊魯制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20103386，批號(hào)：H20030104）；扶陽保元方由制附子20 g（先煎1 h）、白術(shù)15 g、干姜15 g、青皮15 g、茯苓15 g、丹參15 g、郁金15 g、延胡索15 g、炙甘草6 g組成，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，最終含生藥濃度為0.50 g/ml；1640培養(yǎng)基［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：CH19027813.1］；噻唑藍(lán)（MTT）溶液（上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)CH19027813.1）；Transwell小室（上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)：P007810-1）；胰蛋白酶（中國(guó)碧云天公司，批號(hào)041819190617）；SYBR Pre?mix Ex TaqTMⅡ（美國(guó)Takara公司，批號(hào)：AIF2352A）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（中國(guó)碧云天公司產(chǎn)品，批號(hào)：P0009）；ANTI-TGF-βAntibody試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BM5603）；ANTI-SMAD2 Antibody試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BM3992）；ANTI-β-Actin Antibody試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BM0627）；HRP-羊抗兔IgG試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BA1055）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞株的培養(yǎng) QGY-7701細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。每隔2天更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿80%以上密度進(jìn)行傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 扶陽保元方含藥血清的制備 取SD大鼠8只，灌胃給予扶陽保元方溶液（劑量為10 g/kg），灌胃容積為20 ml/kg，2次/天，第7 d（給藥1周達(dá)到血藥濃度峰值）灌胃1 h后處死大鼠取血，3 000 r/min離心10 min取血清、滅活，過濾除菌后，予4 ml離心管分裝并保存于-80℃冰箱，使用時(shí)分別稀釋成5%、10%、20%扶陽保元方含藥血清。

2.3 QGY-7701細(xì)胞增殖的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為空白組、吉西他濱組和扶陽保元方含藥血清高、中、低濃度組，采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)QGY-7701細(xì)胞增殖。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的QGY-7701細(xì)胞，胰酶消化后制作單細(xì)胞懸液（5×104個(gè)/ml），接種到96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁后，空白組每孔加入200μl培養(yǎng)液，扶陽保元方含藥血清低、中、高濃度組每孔分別加入5%、10%、20%含藥血清培養(yǎng)液200μl，吉西他濱組每孔加入20μmol/L的吉西他濱溶液200μl，每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔。孵育培養(yǎng)72 h后，每孔加MTT溶液20μl，孵育4 h，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各個(gè)孔吸光值（OD），然后取平均值，細(xì)胞增殖率計(jì)算公式：細(xì)胞增殖率=藥物組OD值/空白組OD值×100%。

2.4 QGY-7701細(xì)胞侵襲和遷移能力的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組同“2.3”項(xiàng)，采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲與遷移能力。取Matrigel基質(zhì)膠原液置于4℃冰箱內(nèi)過夜融化，基質(zhì)膠和無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶5比例配置稀釋，37℃培養(yǎng)箱中孵育3 h使其成膠待用。上層小室中分別接種各組對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的QGY-7701細(xì)胞至無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，下室加入10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，并用提前預(yù)冷的PBS沖洗，用棉簽擦凈小室膜上表面的基質(zhì)膠和細(xì)胞。加入多聚甲醛固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫染液室溫下染色30 min，PBS中漂洗2遍，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察6個(gè)視野并計(jì)算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)的平均值。

2.5 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）法檢測(cè)NEDD9、TGFβ1、Smad2蛋白的表達(dá)水平 空白組、吉西他濱組（20μmol/L）和扶陽保元方含藥血清中濃度組加入相應(yīng)的藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入RIPA裂解液冰上裂解，12 000 r/min，4℃離心20 min提取總蛋白；采用BCA試劑盒行蛋白濃度測(cè)定，制備樣品；行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，用5%脫脂奶粉封閉1 h，按推薦稀釋比稀釋一抗抗體，一抗4℃孵育過夜，復(fù)溫1 h，二抗室溫孵育1.5 h；最后按1∶1配制ECL顯影液，采用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，灰度分析軟件定量分析。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)NEDD9、TGF-β1、Smad2 mRNA的表達(dá)水平 空白組、吉西他濱組（20μmol/L）和扶陽保元方含藥血清中濃度組加入相應(yīng)的藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，TRIZOL一步法提取每組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取RNA濃度。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7000熒光定量PCR儀上進(jìn)行，各組熒光信號(hào)值由ABI Prism 7000 SDS軟件實(shí)時(shí)產(chǎn)生并自動(dòng)計(jì)算定量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組QGY-7701細(xì)胞增殖情況比較 與空白組比較，扶陽保元方含藥血清低、中、高濃度組和吉西他濱組處理48 h、72 h后人肝癌QGY-7701細(xì)胞增殖均受到明顯的抑制（P＜0.01）。見表1。

表1 各組QGY-7701細(xì)胞增殖情況比較 （%，x±s）

3.2 各組QGY-7701細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 與空白組比較，扶陽保元方低、中、高濃度組和吉西他濱組處理24 h后人肝癌QGY-7701細(xì)胞侵襲和遷移能力均明顯減弱（P＜0.01），見表2。

表2 各組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目比較 （x±s）

3.3 各組QGY-7701細(xì)胞NEDD9、TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)結(jié)果比較 與空白組比較，QGY-7701細(xì)胞經(jīng)10%扶陽保元方含藥血清或吉西他濱（20μmol/L）處理24 h后，NEDD9、TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組NEDD9、TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)結(jié)果比較 （x±s）

3.4 各組QGY-7701細(xì)胞NEDD9、TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)結(jié)果比較 QGY-7701細(xì)胞經(jīng)10%扶陽保元方含藥血清或吉西他濱（20μmol/L）處理24 h后，與空白組比較，NEDD9、TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)均顯著下降（P＜0.01）。見表4。

表4 各組NEDD9、TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)結(jié)果比較 （x±s）

4 討 論

TGF-β1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，其在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，也能通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和促進(jìn)血管生成來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力［11-12］。在對(duì)NEDD9的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)在TGF-β1的刺激下，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)［13-14］以及NEDD9廣泛的酪氨酸磷酸化，NEDD9蛋白的表達(dá)主要是通過誘導(dǎo)NEDD9 mRNA的轉(zhuǎn)錄而引起的，而NEDD9的磷酸化并不需要細(xì)胞的黏附或者不完整的細(xì)胞骨架的刺激。另一方面，一些研究人員卻發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1的刺激下，NEDD9能與Smad、泛素連接酶等蛋白相互作用，以促進(jìn)NEDD9自身的蛋白水解，但這種作用只限制于發(fā)生凋亡的細(xì)胞中［11］。同時(shí)，作為反作用，NEDD9通過調(diào)控Smad的活性，以負(fù)反饋調(diào)節(jié)的形式抑制TGF-β1信號(hào)的持續(xù)刺激［15］，在腫瘤發(fā)展的早期，NEDD9通過這種形式來減輕TGF-β1對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用［16］，且可以在Ras信號(hào)通路的協(xié)同作用下來誘導(dǎo)腫瘤的侵襲遷移；在腫瘤發(fā)展的晚期，NEDD9則可在TGF-β1的刺激下主要發(fā)揮促進(jìn)遷移的作用［12］。由此可見，NEDD9和TGF-β1信號(hào)通路之間的相互協(xié)調(diào)作用，使NEDD9得以充分發(fā)揮其在侵襲、遷移方面的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測(cè)了扶陽保元方對(duì)QGY-7701細(xì)胞增殖抑制能力，結(jié)果表明扶陽保元方能夠有效抑制QGY-7701細(xì)胞增殖。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示扶陽保元方對(duì)QGY-7701細(xì)胞的侵襲與遷移具有明顯的抑制作用。通過檢測(cè)NEDD9、TGF-β1、Smad2的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)情況，Western Blot結(jié)果表明，經(jīng)扶陽保元方處理后QGY-7701細(xì)胞的NEDD9的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，其下游的TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)水平也下調(diào)，NEDD9、TGF-β1、Smad2的mRNA表達(dá)變化與Western Blot結(jié)果一致，說明扶陽保元方能夠在轉(zhuǎn)錄水平抑制NEDD9、TGF-β1、Smad2表達(dá)。提示扶陽保元方很可能是通過調(diào)節(jié)NEDD9蛋白水平從而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移；而TGF-β1通過Smad信號(hào)介導(dǎo)易位到細(xì)胞核，活化的TGF-β1能使Smad2磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移等過程，其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)NEDD9/TGF-β1信號(hào)，進(jìn)而抑制Smad2的蛋白表達(dá)而發(fā)揮抑制人肝癌細(xì)胞增殖侵襲與遷移的作用。