詹磊，孫誠誼

（1.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550000）

膽囊結石疾病作為極為常見的消化系統(tǒng)疾病，在西方人群發(fā)病率為10%～20%[1]，我國目前已經接近發(fā)達國家水平，達到8%～10%，該病是由于膽固醇代謝的平衡紊亂所引起[2]。目前對于該疾病的醫(yī)療花費已經呈現逐年增長的趨勢[3]。盡管已有大量研究[4-6]從基因組學、表觀遺傳學的角度探索膽囊結石的成因，但目前對膽囊結石形成的分子機制仍不十分明確。結石形成的相關危險因素包括，肥胖、2型糖尿病及胰島素分泌紊亂等。因此，越來越多研究者[7-9]支持膽囊結石作為一個代謝綜合征性質的疾病影響患者健康及生活質量。越來越多的研究[10-11]開始關注在表觀遺傳領域，即環(huán)境因素的改變影響基因組的表達與功能從而最終影響膽囊結石的生成。

?；憠A水解酶（cholinesterase，ChE）是一類在體內催化?；憠A水解的酶類。ChE以兩種形式存在于體內：其一為乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE），主要分布在神經組織中；其二為丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BChE），作為已被公認的重要脂肪代謝調控參與者，其主要分布在腸黏膜、肝臟、胰腺和血漿中，大量研究已確立了BChE與異常的脂肪代謝具有重要關聯(lián)。這種聯(lián)系在糖尿病患者、脂肪肝患者和超重患者中尤為明顯，表現為血清總膽堿酯酶均升高[12-13]。作為肥胖相關基因，BChE的表達異常與脂質代謝失常有明顯的關系，而膽囊結石疾病作為代謝異常綜合征已被證明與肥胖密切相關[14-15]。目前尚未有發(fā)表任何關于肥胖相關基因BChE rs1126680以及rs1803274單核苷酸多態(tài)性（SNP）突變與膽囊結石發(fā)病風險相關的研究。在貴州地區(qū)漢族人群中這些SNP與膽囊結石的發(fā)病風險相關性就更不明確。本研究在受試人群中篩選BChE rs1126680以及rs1803274兩個突變位點與人群中的年齡、性別、體質量指數（BMI）狀態(tài)進行相關性分析。最后通過TaqMan?SNP基因分型工具對收集的樣本進行分型檢測，以期探討這兩個位點SNP在受試人群中對膽囊結石發(fā)病的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

所有的膽囊結石疾病病例和健康對照樣本分別來源于2013—2016年貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科因膽囊結石疾病進行住院治療的患者，以及于貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院體檢中心進行體檢的健康人群。研究協(xié)議及試驗流程經貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準并進行全程監(jiān)督（倫理批準號：GYGDWK-01），整項研究獲得所有受檢測參與者的書面知情同意。從296例受試者中獲得其合格的全血樣品，其中包括膽囊結石疾病患者171例，健康對照組人群125例。合并有肝、腎及內分泌系統(tǒng)疾病的膽囊結石患者不被納入該項研究?；颊呒敖】刁w檢者入組后，均簽署知情同意書，采全血樣本10 mL，提取DNA。

1.2 研究方法

1.2.1 人基因組DNA 的提取及純化利用MagCore Compact 核酸抽提儀（芮寶生醫(yī)股份公司，臺灣），以MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit（Cat.No.MGB400-04）試劑盒提取全血基因組DNA，取DNA 樣本2 μL 用NanoDrop 測定DNA純度和濃度，確保OD260/OD280＞1.8 至2.0 之間。

1.2.2 TaqMan? 熒光探針檢測及SNP 基因分型3 個SNP 基因型的探針序列及基因信息見表1。反應體系是由20×，40×，80×TaqMan?Genotyping Assay以及TaqMan?Genotyping Master Mix，nuclease-free 水所組成。標準的PCR 反應體系的建立應當為5 μL 體系/孔（384 孔PCR 反應板）；10 μL 體系/孔（96 孔PCR 反應板），按照標準建立反應體系。采用安捷倫mx3000p?序列檢測系統(tǒng)（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）利用VIC?和FAM?兩個熒光檢測通道進行基因變異檢測。繪制位基因分型/SNP 實時熒光定量散點分布圖，并進行等位基因分型/SNP 實時熒光定量最終結果判定[16-18]。

表1 探針序列及基因信息Table 1 Probe sequence and gene information

1.2.3 BChE 基因2 個多態(tài)位點與膽囊結石發(fā)病風險分析為了分析BChE rs1126680 以及rs1803274 等位基因基因型與膽囊結石疾病的臨床特征相關性，采用二元Logistic 回歸分析的方法進行相關評估。關于crude odds ratio 的計算，以是否發(fā)生膽囊結石疾病作為因變量，而rs1126680以及rs1803274 的基因分型則作為獨立變量。通過Logistic 回歸分析將等位基因的分型數據與膽囊結石疾病的發(fā)生作為獨立危險因素進行建模判斷，更進一步的將膽囊結石的發(fā)生通過危險分層的方法與年齡，性別，BMI 進行確定與調整。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有的生化指標以及基因表達數據均采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。對計量資料的組間比較使用t檢驗。等位基因頻率計算采用的是直接計數方法，采用Pearson χ2檢驗或者Fisher's確切分析。使用Hardy-Weinberg平衡以及各等位基因型樣本大小的差異。采用二元Logistic回歸分析的方法進疾病危險因素評估。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 資料分析

膽囊結石疾病組與健康人群除在血液中，低密度脂蛋白（LDLC）與高密度脂蛋白（HDLC）存在明顯差異（P=0.028、P=0.015），其余臨床指標的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。膽囊結石患者組平均年齡為（46.1±9.2）歲，健康對照組平均年齡為（53.2±5.6）歲，兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.267）。其中膽囊結石患者組（男72例，女99例）和健康對照組（男51例，女74例）性別差異無統(tǒng)計學意義（P=0.905），組間具有可比性（表2）。等位基因位點基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=0.641，P＞0.05），選擇的樣本具有群體代表性。

表2 受試者臨床特征分析Table 2 The clinical features of the studied subjects

2.2 ABCG8 rs11887534，BChE rs1803274 以及rs1126680 的等位基因頻率分布

TaqMan?探針基因分型結果顯示，3個標簽SNP成功分型，并且每個標簽SNP的分型成功率99.3%（圖1）。ABCG8基因（D19H）rs11887534作為陽性對照與文獻報道的結果一致[46]。BChE rs1803274（P=1.312×10-15）多態(tài)性與膽囊結石疾病的發(fā)生存在相關性。與對照組相比隨著rs1803274雜合子等位基因的增加，人群患膽囊結石疾病的風險將會增加。然而肥胖相關基因BChE rs1126680（P=0.616）與膽囊結石疾病無關（表3-4）。

2.3 BChE rs1803274 與膽囊結石臨床指標的關聯(lián)性分析

對膽囊結石受試組各等位基因的基因表型，也就是攜帶純合子CC，雜合子CT和純合子TT基因型的BChE rs1803274的相關數據進行關聯(lián)分析。通過Logistic回歸分析將等位基因的分型數據與膽囊結石疾病的發(fā)生作為獨立危險因素進行建模判斷，更進一步的將膽囊結石的發(fā)生通過危險分層的方法與年齡，性別和BMI進行確定與調整。BChE rs1803274雜合子CT突變可以作為膽囊結石疾病發(fā)病的獨立遺傳風險因素。Logistic回歸分析的建模與結果表明，在女性人群中BChE rs1803274雜合子CT基因型將比純合子CC及純合子TT存在更高的膽囊結石疾病的發(fā)病風險（95% CI=0.237～0.772，P=0.009）。

圖1 基因分型散點圖 A：rs11887534 分型；B：rs1803274 分型；C：rs1126680 分型Figure 1 Scatter plots of genotyping A:The rs11887534;B:The rs1803274;C:The rs1126680

表3 目標等位基因SNP 信息Table 3 Information of the target alleles

表4 膽囊結石患者目標基因SNP 突變頻率[n（%）]Table 4 Frequency of mutation of the SNPs of the target genes in patients with gallstones[n (%)]

3 討論

膽囊結石疾病在歐美發(fā)達地區(qū)是非常普遍的一種消化系統(tǒng)疾病，和亞洲及非洲人群相比，其發(fā)病率更高[1]。這種差異被認為可能與飲食習慣和遺傳因素有關[19-22]。在296例受試者中，包括171例膽結石受試者以及125例健康對照樣本中，隨著BChE基因rs1803274突變，膽囊結石疾病的發(fā)病風險明顯增加。rs1803274雜合子CT在貴州省漢族受試人群中與膽囊結石發(fā)病相關。作為陽性對照，所有ABCG8 D19H的突變與臨床情況類似于以前的相關報道[23]，這也同時證明了實驗數據的可靠性。本研究還比較了膽囊結石患者與健康對照組的相關臨床特征，膽囊結石患者組的LDLC均明顯高于對照組，然而膽囊結石患者組的HDLC則明顯低于健康組。

膽囊結石的形成是受多基因調控的復雜過程，該疾病受到遺傳和環(huán)境的雙重影響，是一種代謝紊亂綜合征。膽結石形成的遺傳易感、危險因素主要包括年齡，性別，肥胖，以及特定藥物的使用[24]。大量研究已確立了BChE與異常的脂肪代謝具有重要關聯(lián)。這種聯(lián)系在糖尿病患者、脂肪肝患者和超重患者中尤為明顯，表現為血清總膽堿酯酶均升高。Cucuianu等[12]報道2型糖尿病體質量超重的患者，其血清BChE顯著升高，并且提出BChE對血清胰島素、游離脂肪酸和C肽的表達具有明顯的調控作用。該研究還指出糖尿病疾病模型犬血清BChE水平顯著升高，合并肥胖的犬血清BChE含量進一步增加。糖尿病模型家兔BChE高于對照組，給予抗膽堿酯酶藥溴化斯的明治療后，空腹血糖含量明顯下降[25]。研究[26]提出血清BChE升高是脂肪肝的突出生化指標的觀點，血清中BChE指標更加能夠反映肝臟對脂肪代謝能力。隨著我國經濟的飛速發(fā)展，中國人群飲食總體熱量逐年增高[27]。人群的運動量開始減少，脂肪消耗也減少，從而極易造成脂肪堆積，引發(fā)高脂血癥和肥胖癥[28]。值得注意的是，在糖尿病合并高脂血癥的患者中，體內脂肪酸合成和轉化增加，肝細胞內的脂肪增多，脂肪變性的肝細胞數量增加，導致肝中酰基輔酶A大量累積，其進一步代謝產物可產生大量?；憠A，而正是酰基膽堿成為血清ChE的主要底物。所以血清中BChE含量升高可能是由于大量底物誘導肝合成酶增加而形成[29]。BChE作為肥胖相關基因，其表達出現異常提示著紊亂的脂質代謝過程，這與膽囊結石疾病的發(fā)生有著極強的聯(lián)系[30]。

BChE基因在脂質代謝及代謝紊亂綜合征的發(fā)生發(fā)展過程中扮演極為重要的角色，但是，BChE基因與膽囊結石疾病的聯(lián)系及該基因SNP突變對膽囊結石產生的相關研究卻仍屬空白。本研究通過病例對照研究探討貴州地區(qū)漢族人群肥胖基因BChE基因SNP位點與膽囊結石疾病發(fā)病風險的相關性。選取171例貴州省漢族膽囊結石患者和125例健康對照者入組。采用TaqMan?探針技術，對肥胖相關基因BChE rs1126680、rs1803274進行基因分型。發(fā)現隨著BChE rs1803274 SNP突變，人群患膽囊結石疾病的風險將會升高，更加增加了女性罹患膽囊結石的發(fā)病風險。然而肥胖相關基因BChE rs1126680為與膽囊結石疾病發(fā)病風險無意義的突變位點。本研究為膽囊結石的成因研究及膽囊結石遺傳易感性檢測相關研究提供了最新的工作基礎。