楊松運(yùn),李剛池,徐少華,莫松全,王飛鳳,何興川

(1.三臺(tái)縣人民醫(yī)院，四川 三臺(tái) 621100；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

深靜脈血栓(DVT)形成是骨科大手術(shù)，特別是髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后常見并發(fā)癥，形成率為42%～57%[1]，DVT脫落可導(dǎo)致肺栓塞，其中以致死性肺栓塞為其最嚴(yán)重后果[2]，致死性肺栓塞形成率為2%～7%，搶救成功率低。但目前對(duì)于DVT形成的預(yù)測(cè)指標(biāo)價(jià)值不高，臨床上需要尋找一種快速且準(zhǔn)確性高的預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究通過選取來我院行初次單側(cè)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者122例，通過術(shù)前術(shù)后檢測(cè)血漿中P-選擇素的含量來探討其預(yù)測(cè)DVT形成的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)前診斷：?jiǎn)蝹?cè)股骨頭缺血壞死(FicatⅢ～Ⅳ期)，按照Ficat分期(Ⅲ期80例、Ⅳ期42例)；②對(duì)照組為自愿者、體檢結(jié)果健康；③本研究獲得研究對(duì)象的知情同意；④本次研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn):糖尿病足微血管疾病、血友病等血液疾病，靜脈血栓病史，慢性腎臟疾病史，心房纖顫、心室纖顫、不穩(wěn)定型心絞痛等心臟疾病，心臟瓣膜缺失或瓣膜手術(shù)后病史，婦科惡性腫瘤手術(shù)病史，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)有骨折及臥床病史。

選擇2016年1月～2018年3月在我院行初次單側(cè)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的住院患者122例，男67例，女55例，平均年齡(62.0±16.8)歲，手術(shù)均為同一術(shù)者，手術(shù)入路均采用髖關(guān)節(jié)后外側(cè)切口，手術(shù)患者均無相關(guān)血栓病史?；颊咝g(shù)前12 h及術(shù)后10 d均使用低分子肝素鈉進(jìn)行抗凝治療，所有患者均于術(shù)前及術(shù)后3 d、6 d、10 d行患肢彩色多普勒超聲檢查,但如果健側(cè)肢體或雙上肢出現(xiàn)腫脹則同時(shí)行該部位的彩色多普勒超聲檢查；另外根據(jù)患者隨訪情況(出院后隨訪3個(gè)月),如隨訪中發(fā)現(xiàn)患肢腫脹未消退或加重行彩色多普勒超聲檢查。根據(jù)術(shù)后彩色多普勒超聲檢查結(jié)果將患者分為深靜脈血栓(DVT)組(淺靜脈或肌間靜脈血栓未納入此組)和非DVT組(淺靜脈或肌間靜脈血栓未納入此組)，與正常對(duì)照組比較；正常對(duì)照組為來我院做健康檢查者70例，既往均無相關(guān)血栓病史，其中男45例，女25例，平均年齡(55±13.8)歲。

1.2標(biāo)本收集、處理及保存方法

1.2.1收集標(biāo)本:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，試管內(nèi)使用檸檬酸鹽抗凝，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激；分別于術(shù)前及術(shù)后2 d收集患者清晨空腹靜脈血液后，3 000 r/min離心10 min取上清液備用。

1.2.2保存:標(biāo)本收集后凍存于-20℃醫(yī)用冰箱待測(cè)。

1.3操作步驟:使用僅用于科研的人(Human)P-選擇素(P-Selectin/CD62P/GMP140)ELISA 檢測(cè)試劑盒。①從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃；②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；③樣本孔先加待測(cè)樣本 10 μl，再加樣本稀釋液40 μl；空白孔不加；④除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體 100 μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60 min；⑤棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去；⑥每孔加入底物 A、B 各50 μl，37℃避光孵育15 min；⑦每孔加入終止液50μl，15 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

1.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。試劑盒由上海羽朵生物有限公司提供。酶標(biāo)儀為上?？泼繩HBST-360酶標(biāo)儀。

2 結(jié) 果

2.1隨訪情況：出院后3個(gè)月內(nèi)到門診隨訪共103例,門診隨訪率84.43%。其中因DVT脫落致肺栓塞死亡1例(通過尸檢明確),本組病例中DVT脫落至肺栓塞死亡率為8.3%。隨訪中發(fā)現(xiàn)肢體腫脹行彩色多普勒超聲檢查共31例。術(shù)后患者下肢靜脈血栓形成有30例，其中淺靜脈及肌間靜脈血栓形成者共18例，未納入數(shù)據(jù)分析；DVT形成者12例。

2.2髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)前、后血漿P-選擇素含量比較：DVT組、非DVT組術(shù)前P-選擇素與正常對(duì)照組血漿P-選擇素含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DVT組、非DVT組術(shù)前D-二聚體與正常對(duì)照組血漿D-二聚體含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DVT組、非DVT組術(shù)后P-選擇素含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)前、后血漿P-選擇素含量比較

2.3髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)前、后血漿D-二聚體含量比較：DVT組、非DVT組術(shù)后血漿D-二聚體含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)前、后血漿D-二聚體含量比較

2.4術(shù)后深靜脈血栓患者P-選擇素及D-二聚體相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)列表及圖示:術(shù)后DVT患者不同P-選擇素臨界值時(shí)的敏感度、特異性、陽性似然比。見表3。

表3 DVT患者不同P-選擇素臨界值時(shí)的敏感度和特異性

術(shù)后DVT患者不同D-二聚體臨界值時(shí)的敏感度、特異性、陽性似然比。見表4。術(shù)后DVT患者P-選擇素ROC曲線圖，見圖1。術(shù)后DVT患者D-二聚體ROC曲線圖，見圖2。兩種方法的ROC曲線圖比較，P-選擇素ROC曲線下面積(0.726)>D-二聚體ROC曲線下面積(0.512)，見圖3。當(dāng) P-選擇素診斷臨界值為8 ng/ml 時(shí)，AUC(曲線下面積)最大為0.687。見圖1。

表4 DVT患者不同D-二聚體臨界值時(shí)的敏感度和特異性

圖1 術(shù)后DVT患者P-選擇素ROC曲線

圖2 術(shù)后深靜脈血栓患者D-二聚體ROC曲線

圖3 兩種方法的ROC曲線比較

3 討論

DVT是指血液非正常地在深靜脈內(nèi)凝結(jié)，屬于下肢靜脈回流障礙性疾病。血栓形成大都發(fā)生于制動(dòng)狀態(tài)(尤其是骨科大手術(shù))。致病因素有血流緩慢、靜脈壁損傷和高凝狀態(tài)三大因素。血栓形成后，除少數(shù)能自行消融或局限于發(fā)生部位外，大部分會(huì)擴(kuò)散至整個(gè)肢體的深靜脈主干。下肢DVT形成約占周圍血管性疾病的60%，如果在急性期階段不能及時(shí)診斷并給予有效的治療，可引起靜脈血栓后遺癥以及致命性肺栓塞[3]。

DVT在髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生率較大，根據(jù)美國骨科醫(yī)師學(xué)會(huì)發(fā)布的擇期髖膝關(guān)節(jié)置換患者靜脈血栓栓塞性疾病預(yù)防臨床實(shí)踐[4]，美國每年開展大約250 000例髖關(guān)節(jié)置換，如果不采取抗凝預(yù)防措施，大約37%的患者置換后會(huì)出現(xiàn)影像學(xué)或者超聲手段可以檢測(cè)出的DVT。

目前預(yù)測(cè)DVT形成的方法主要是檢測(cè)血漿D-二聚體含量。各國學(xué)者也進(jìn)行了大量研究，Watanabe等研究發(fā)現(xiàn)，行多排計(jì)算機(jī)斷層CT掃描的無癥狀DVT患者中，DVT組的D-二聚體水平在置換后第4天比無DVT組顯著增高，敏感性和特異性分別為75%和63%，作者得出結(jié)論血漿D-二聚體正?？膳磐釪VT診斷，但不能作為預(yù)測(cè)DVT形成的特異性指標(biāo)[5]。2014年歐洲心臟病學(xué)會(huì)發(fā)布的急性肺栓塞診斷和管理指南指出，D-二聚體的特異性隨著年齡的增長(zhǎng)下降[6]。本研究發(fā)現(xiàn)：術(shù)后患者血漿中D-二聚體含量普遍增高，超過500 μg/L，術(shù)后DVT組與非DVT組D-二聚體含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明D-二聚體不能作為髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后預(yù)測(cè)DVT形成的特異性指標(biāo)。

目前診斷血栓形成的方法主要是下肢血管彩色多普勒超聲及血管造影技術(shù),血管彩色多普勒超聲對(duì)下肢DVT形成的診斷較高，靜脈造影雖然是診斷血栓的金標(biāo)準(zhǔn)，但它是一種有創(chuàng)性檢查，且上述兩種方法只針對(duì)已形成血栓的檢查，并不能早期預(yù)測(cè)DVT的形成。

P-選擇素是近年來發(fā)現(xiàn)的血栓起始形成的重要啟動(dòng)參與者，是血栓早期的一個(gè)分子標(biāo)志物。正常情況下血小板處于靜息狀態(tài)，當(dāng)受到病理性的刺激時(shí)，血小板活化，在血栓形成過程中，血小板的活化具有重要意義，是血栓前狀態(tài)的重要指標(biāo)[7]，在血小板活化過程中隨著活化血小板的脫顆粒，靜息血小板胞質(zhì)內(nèi)α顆粒膜上的糖蛋白P-選擇素(CD62P)和溶酶體膜上的CD63與血小板膜融合進(jìn)行標(biāo)記[8]，P-選擇素主要存在于靜息狀態(tài)下血小板的α顆粒膜上，是反映血小板活化的重要標(biāo)志物，當(dāng)血小板出現(xiàn)活化反應(yīng)時(shí)，通過開放的管道系統(tǒng)，血小板內(nèi)的α顆粒與質(zhì)膜融合，從而使血小板質(zhì)膜上的P-選擇素分子表達(dá)量增加[9]。Trzeciak等也發(fā)現(xiàn)P-選擇素是衡量血小板釋放功能的重要指標(biāo)[10]。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)P-選擇素在靜止血小板的α顆粒及活化的血小板質(zhì)膜上的膜糖蛋白顆粒均有表達(dá)，是評(píng)估血小板活化的“金標(biāo)準(zhǔn)”[11]。國內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在一定程度上P-選擇素作為下肢DVT形成的早期診斷和早期預(yù)測(cè)指標(biāo)具有重要意義[12]。趙紅麗等研究也發(fā)現(xiàn)監(jiān)測(cè)外周血P-選擇素水平有益于識(shí)別存在高凝狀態(tài)及血栓形成傾向的患者，及時(shí)干預(yù)，預(yù)防栓塞發(fā)生[13]。

本研究122例患者中有30例發(fā)生下肢靜脈血栓，發(fā)生幾率為24.59%，其中12例形成下肢DVT，發(fā)生幾率為9.8%，其中7例DVT形成是發(fā)生在術(shù)后2周～3個(gè)月左右,這7例中有1例患者(肥胖且平時(shí)活動(dòng)量少)術(shù)后15 d因DVT致肺栓塞死于家中，該患者因怕疼痛拒絕下地功能鍛煉，其余6例調(diào)查發(fā)現(xiàn)患者患肢稍腫脹，運(yùn)動(dòng)功能良好，彩色多普勒超聲檢查血栓形成但血流信號(hào)通暢，追問患者并未按時(shí)服用抗凝藥物預(yù)防血栓形成，這與美國骨科醫(yī)師學(xué)會(huì)發(fā)布的報(bào)告相符合[4]：如果不采取抗凝預(yù)防措施，大約37%的患者置換后會(huì)出現(xiàn)影像學(xué)或者彩色多普勒超聲手段可以檢測(cè)出的DVT。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后DVT組、非DVT組P-選擇素含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且P-選擇素ROC曲線下面積>D-二聚體ROC曲線下面積，表明P-選擇素對(duì)初次全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT的形成其預(yù)測(cè)價(jià)值更加合理，應(yīng)該優(yōu)先選擇,可以作為初次全髖關(guān)節(jié)置換圍手術(shù)期預(yù)測(cè)下肢DVT形成的特異性指標(biāo)。

需要說明的是本研究選擇的患者是股骨頭缺血壞死行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)，對(duì)于股骨頸骨折未納入此次研究，另外研究檢測(cè)使用的是上?？泼繩HBST-360酶標(biāo)儀，試劑盒是由上海羽朵生物有限公司提供。不同試劑盒的測(cè)量原理及試劑成分可能不同，因而測(cè)量得到的相關(guān)數(shù)據(jù)不一定適合于其他品牌的儀器和試劑。