陳曉紅，吳廣勝，農(nóng)衛(wèi)霞，潘 歆，王 燕，張紅霞，章大謙，龍珍珠瑪

(1.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，新疆 石河子 832000)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是起源于造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，白血病細(xì)胞在細(xì)胞周期中出現(xiàn)增殖失控、分化障礙和凋亡受阻，并且大量蓄積于骨髓和其他造血組織，從而抑制骨髓正常造血功能并浸潤多器官。近些年來，隨著化療、特異性靶向治療、骨髓移植等治療技術(shù)的不斷更新改進(jìn)，其治療效果不斷提高，AML患者的總體疾病緩解率可達(dá)50%～80%，但是仍有著65%左右的患者大約在3～5年內(nèi)復(fù)發(fā)[1]，成年人總體生存率僅為24%～28%[1-2]。AML誘導(dǎo)化療獲得形態(tài)學(xué)完全緩解后(complete remission，CR)，患者體內(nèi)仍有108的白血病殘留細(xì)胞，被稱為微小殘留病(minimal residual disease,MRD)[3]。近幾年研究表明，微小殘留病檢測對AML患者的早期復(fù)發(fā)、預(yù)后判斷及調(diào)整治療方案等具有重要意義[4]。本文主要對我院AML患者的資料進(jìn)行回顧性分析，討論MRD在AML疾病治療中的預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1研究對象：以2015年1月～2019年1月在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科確診的非M3型AML患者為研究對象，經(jīng)除外主動(dòng)放棄治療患者，最終獲得有效數(shù)據(jù)40例，其中有男24例，女16例，年齡19～82歲，平均56歲。40例中經(jīng)初次誘導(dǎo)化療后未緩解(NR)或部分緩解(PR)13例，CR27例。AML診斷符合WHO 2016版《造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)》[5]，臨床CR標(biāo)準(zhǔn)參照張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[6](本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意)。

1.2治療方案：AML 誘導(dǎo)緩解采用標(biāo)準(zhǔn) DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷)、IA(去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷)方案，鞏固化療 AML 采用 DAMA、HA、HDA等。

1.3研究方法：

1.3.1MRD檢測方法：采用流式細(xì)胞術(shù)，抽取誘導(dǎo)治療后2周及緩解后鞏固治療前后患者骨髓作為標(biāo)本,涂片6～8張作為形態(tài)學(xué)分析,同時(shí)采集3 ml骨髓用肝素抗凝,并送往北京海斯特公司進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)采集并進(jìn)行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色體核型分析等檢測，結(jié)果采用MRD>0.01%作為MRD陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2預(yù)后分層標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國診療指南(2017年版)將納入患者按照細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)檢測結(jié)果將確診患者分層為預(yù)后良好、預(yù)后中等、預(yù)后不良。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料采用配對設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)或兩獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)；定性資料采用獨(dú)立樣本R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn)。按α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在本研究中，共有79名患者在4年的時(shí)間內(nèi)累積，其中20例患者于確診后未在我院繼續(xù)治療，其余9名患者因經(jīng)濟(jì)等不同原因放棄治療，10例患者最終FAB分型為M3型。將這些患者排除后，剩余40例患者納入這項(xiàng)研究來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.1首次化療后不同MRD水平的緩解情況以及與預(yù)后分層的關(guān)系：40例患者，首次化療后檢測MRD水平，其中MRD陽性組為21例，其中9例未達(dá)到形態(tài)學(xué)完全緩解，12達(dá)到形態(tài)學(xué)完全緩解，MRD陰性組共19例，其中形態(tài)學(xué)緩解患者15例，未達(dá)到形態(tài)學(xué)完全緩解患者為4例，MRD陽性組與MRD陰性組的緩解情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

40例AML患者，預(yù)后良好組患者共9例，首次誘導(dǎo)治療后MRD陰性患者7例，MRD陰性率77.70%；預(yù)后中等組14例患者中首次誘導(dǎo)后MRD陰性患者8例，MRD陰性率57.10%；預(yù)后不良組患者共17例，其中MRD陰性患者4例，MRD陰性率23.50%。三組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.026，P=0.029)，見表1。

表1 MRD水平與細(xì)胞遺傳學(xué)分布相關(guān)性關(guān)系

2.2完全緩解患者不同MRD水平與復(fù)發(fā)的關(guān)系：27例達(dá)到形態(tài)學(xué)完全緩解的患者持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測MRD水平并進(jìn)行隨訪，最終9例MRD持續(xù)陽性患者復(fù)發(fā)8例，復(fù)發(fā)率88.89%，MRD持續(xù)陰性患者11例，復(fù)發(fā)3例，復(fù)發(fā)率27.27%，MRD水平由陽性轉(zhuǎn)為陰性患者3例，復(fù)發(fā)2例，復(fù)發(fā)率66.67%，MRD水平由陰性轉(zhuǎn)陽性患者4例，復(fù)發(fā)1例，復(fù)發(fā)率25.00%，四組復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.026，P=0.029)，見表2。

表2 形態(tài)學(xué)完全緩解時(shí)不同MRD水平與復(fù)發(fā)率的關(guān)系

2.3緩解后不同MRD水平患者的生存曲線：27例緩解患者中，據(jù)統(tǒng)計(jì)至隨訪結(jié)束，初次化療后MRD為陽性水平的平均生存時(shí)間為18.71(95%CI:11.13～26.28)，中位生存時(shí)間12.00(95%CI:6.91～17.09);陰性水平的平均生存時(shí)間為30.30(95%CI:4.32～21.82)。首次化療后不同MRD水平的生存曲線如圖1。

圖1 完全緩解患者首次化療后不同MRD水平的生存曲線

3 討論

急性髓系白血病(AML)是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤性疾病。近年來，AML的治療方法和水平不斷進(jìn)步，但是AML患者體內(nèi)的MRD并未被完全清除，這也就導(dǎo)致著AML患者預(yù)后不能達(dá)到理想狀態(tài)。故而，作為目前研究的熱點(diǎn)，AML的治療的終極目標(biāo)是在完全緩解的基礎(chǔ)上檢測出MRD并完全清除從而達(dá)到長期無病生存甚至治愈。因而，本文旨在通過對我院AML患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析從而評價(jià)MRD在AML中的臨床價(jià)值。

本研究對40例AML患者在初次誘導(dǎo)化療后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測MRD水平，并分析其形態(tài)學(xué)緩解情況，發(fā)現(xiàn)不同MRD水平之間的CR率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)在AML患者診斷初期對其依據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)進(jìn)行預(yù)后分層，對各層患者的初治后MRD水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于預(yù)后中等組和預(yù)后不良組，預(yù)后良好組具有更高的MRD陰性率(77.70%)，而其他兩組MRD陰性率僅為57.10%、23.50%。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)預(yù)后分層能夠在治療前對AML患者做出一定的預(yù)后判斷，結(jié)合初治MRD檢測水平后可能能夠更精準(zhǔn)預(yù)測預(yù)后，從而能夠在治療早期選擇合適的治療方案，以便獲得早期緩解及早期預(yù)防復(fù)發(fā)，從而提高患者的緩解率及延長無病生存期等。隨后筆者又對其中27例獲得CR的患者M(jìn)RD水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測并追蹤隨訪，我們發(fā)現(xiàn)MRD持續(xù)陽性患者復(fù)發(fā)8例，而MRD持續(xù)陰性患者僅復(fù)發(fā)3例，MRD持續(xù)陽性組復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于MRD持續(xù)陰性組(88.89%VS27.70%)，表明MRD的持續(xù)存在是復(fù)發(fā)的根源，這是由于，在臨床上完全緩解的概念是指患者血液學(xué)指標(biāo)提示骨髓中白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)<5%，但是這僅僅不足5%的白血病細(xì)胞可能造成惡性克隆性增殖，從而導(dǎo)致疾病難以控制；本文還對CR不同MRD水平的患者進(jìn)行了生存分析，結(jié)果顯示MRD陽性組與MRD陰性組生存期并無差異，這與國內(nèi)外大多數(shù)研究結(jié)果不一致，需增加樣本量及延長隨訪時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。

AML復(fù)發(fā)是其預(yù)后不良因素之一[7]。國內(nèi)牟銳等[8]對129例初治復(fù)發(fā)AML患者進(jìn)行MRD早期檢測結(jié)果顯示：MRD早期轉(zhuǎn)陰者與MRD陽性者CR率比較，分別為26.53%與83.87%(P<0.001)。隨訪半年后發(fā)現(xiàn)MRD陽性組復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于MRD陰性組。此結(jié)果與本文結(jié)果相似，高水平MRD可導(dǎo)致高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但是，MRD陰性并不能完全排除復(fù)發(fā)，本文中MRD持續(xù)陰性組尚有3例復(fù)發(fā)，故而，早期檢測MRD并不能作為預(yù)測復(fù)發(fā)情況的唯一證據(jù)，仍需流式細(xì)胞術(shù)持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測MRD水平；目前普遍認(rèn)為，在AML治療過程中，MRD水平是一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后因素。有研究對346例患者的2 569個(gè)骨髓樣本進(jìn)行了MRD監(jiān)測，并進(jìn)行了多因素分析結(jié)果顯示，微小殘留病的存在是死亡的唯一獨(dú)立預(yù)后因素[9]。本文通過MRD水平聯(lián)合分子學(xué)預(yù)后分層，對不同預(yù)后分層的MRD陰性率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)分子學(xué)預(yù)后較好的組可以獲得較高的MRD陰性情況，這與國內(nèi)某研究[10]有著完全相反的結(jié)論。更多國外研究表明[11-12]，NPM1突變與好更高的CR、改善總的OS、更低的復(fù)發(fā)累積發(fā)生率相關(guān)，而FLT3等預(yù)后不良基因則恰好相反，這與本文研究基本符合。Terwijn M等[13]報(bào)道517成年AML患者動(dòng)態(tài)檢測結(jié)果顯示：MRD水平≥0.1%具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。而Jentzsch M等[14]的研究則以MRD 0.01%為界限，水平>0.01%的患者3年復(fù)發(fā)率是水平<0.01%患者的3倍以上，因此認(rèn)為可以將MRD檢測結(jié)果作為預(yù)后分層標(biāo)準(zhǔn)之一，從而對治療方案進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整，MRD持續(xù)陰性者則可以降低治療強(qiáng)度，MRD持續(xù)陽性這則考慮改變化療方案、增強(qiáng)化療或進(jìn)行骨髓移植等。

國內(nèi)外關(guān)于AML-MRD檢測的方法和時(shí)間點(diǎn)不盡統(tǒng)一。國內(nèi)大多數(shù)檢測方法為多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(multiparametric flow cytometry，MFC)[15]，相比于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢測方法，此法具有檢測簡便，敏感性較高等優(yōu)點(diǎn)，但是僅能檢測白血病細(xì)胞異常表面抗原，不能對正常免疫表型的白血病細(xì)胞做出評估。而國外多采用實(shí)時(shí)定量PCR(rt-qPCR)和二代測序(NGS)作為AML-MRD的檢測方法，雖然相較于流式細(xì)胞術(shù)，以上兩種方法能夠獲得更好的敏感性，但由于上述方法局限于檢測技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)與操作水平，并不能獲得客觀的MRD評估，如若能夠?qū)⒁陨蠋追N常用方法結(jié)合進(jìn)行AML-MRD檢測，可能能夠取得更有效的結(jié)果。AML-MRD檢測的時(shí)間點(diǎn)，國內(nèi)外不同實(shí)驗(yàn)室選擇不同的時(shí)間點(diǎn)，包括誘導(dǎo)化療后7 d、誘導(dǎo)治療開始后14 d、16 d、第 1 次形態(tài)學(xué) CR 后、誘導(dǎo)化療和強(qiáng)化化療末等[16-17]，均發(fā)現(xiàn)MRD陽性組的復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于MRD陰性組，且具有更低的無病生存期[18]。歐洲白血病網(wǎng)[19]建議至少在診斷時(shí)、兩個(gè)誘導(dǎo)/鞏固治療周期后、隨訪期間每3個(gè)月進(jìn)行MRD評估與預(yù)測預(yù)后、防止復(fù)發(fā)有重要作用。本研究采用初次誘導(dǎo)后2周作為早期MRD水平檢測，在鞏固治療和強(qiáng)化治療前后均檢測MRD水平，從而對疾病復(fù)發(fā)和預(yù)后做出評估，結(jié)果與國內(nèi)外多數(shù)研究結(jié)果一致。

綜上所述，AML患者在治療期間動(dòng)態(tài)監(jiān)測MRD水平對于提前判斷復(fù)發(fā)，及時(shí)調(diào)整合適的治療方案，進(jìn)行個(gè)性化治療，有效提高患者的預(yù)后有著十分積極的作用和臨床應(yīng)用價(jià)值。若可將MRD水平作為預(yù)后分層標(biāo)準(zhǔn)，與分子遺傳學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)預(yù)后分層結(jié)合，可能能夠?qū)颊叩念A(yù)后做出更為精準(zhǔn)的預(yù)測。并且隨著二代測序技術(shù)(NGS)的發(fā)展， 逐漸發(fā)現(xiàn)眾多遺傳標(biāo)志物(如IDH1、IDH2、WT-1等)的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，MRD檢測將在AML的治療中起到越來越重要的作用。