曹琴英，彭園園，穆衛(wèi)紅，孫東蘭，張靜

(石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，石家莊 050000)

臨床上自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%～25%，其中≥2次流產(chǎn)的患者約占生育期婦女的5%，而≥3次者約占1%。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion，RSA)有多種原因，主要包括遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素、免疫功能異常、血栓前狀態(tài)、孕婦的全身性疾病及環(huán)境因素等[1]。然而，50%的RSA患者病因不明。其中，遺傳因素被認(rèn)為是主要的潛在原因[2]。

脆性X智力障礙l號(hào)基因(Fragile X Mental Retardation 1，F(xiàn)MR1)，又稱(chēng)家族性智力低下基因，位于染色體Xq27.3。FMR1基因5’端非編碼區(qū)CGG三核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列具有高度多態(tài)性。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)院(ACMG)的脆性X檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和指南[3]，5～44個(gè)CGG重復(fù)為正常，45～54個(gè)CGG重復(fù)為中間型，55～200個(gè)CGG重復(fù)為前突變，大于200個(gè)CGG重復(fù)為全突變。全突變的臨床表型即為脆性X綜合征，在臨床上有典型的遺傳性智力低下或自閉癥等表現(xiàn)。

近年來(lái)，多項(xiàng)研究顯示，CGG重復(fù)序列多態(tài)性可能在女性不明原因RSA中發(fā)揮重要作用。目前，我國(guó)尚缺乏大樣本育齡女性FMR1基因多態(tài)性的數(shù)據(jù)，探討RSA患者FMR1基因CGG重復(fù)序列數(shù)是否高于普通人群的研究更少。本研究旨在對(duì)不明原因RSA女性FMR1基因CGG重復(fù)序列多態(tài)性的分布特點(diǎn)進(jìn)行分析，以期為自然流產(chǎn)的病因?qū)W研究提供參考。

資料和方法

一、研究對(duì)象

研究人群為2018年1月1日至2019年12月31日從石家莊市第四醫(yī)院復(fù)發(fā)性流產(chǎn)門(mén)診招募的不明原因RSA患者。RSA定義為3次或3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失。但大多數(shù)專(zhuān)家認(rèn)為，連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)即應(yīng)重視并予評(píng)估，因其再次出現(xiàn)流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)與3次者相近[1]。

納入標(biāo)準(zhǔn)：漢族；年齡<40歲，以最大限度減少因卵巢老化導(dǎo)致的流產(chǎn)患者；連續(xù)≥2次孕20周以?xún)?nèi)的妊娠丟失，且臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查未檢出明確原因。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染引起的流產(chǎn)史、當(dāng)前處于妊娠期或產(chǎn)褥期、血栓性疾病、深靜脈血栓形成或肺部病史、子宮或輸卵管解剖異常、宮頸機(jī)能不全、骨盆手術(shù)史(不包括剖宮產(chǎn))、酗酒/藥物濫用、癌癥史、染色體異常核型以及輔助生殖技術(shù)助孕者。

以同期于石家莊第四醫(yī)院婦科門(mén)診就診的年齡匹配(±2歲)的無(wú)流產(chǎn)史婦女為對(duì)照組。

本研究經(jīng)石家莊市第四醫(yī)院倫理評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均自愿進(jìn)行該項(xiàng)檢查，并簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.樣品采集與DNA提?。撼槿⊙芯繉?duì)象外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝。使用QIAamp全血DNA提取試劑盒(Qiagen，德國(guó))提取DNA，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。NanoDrop 1000(Nanodrop，美國(guó))測(cè)定DNA濃度。

2.FMR1基因CGG重復(fù)數(shù)檢測(cè)：采用FMR1基因CGG重復(fù)數(shù)檢測(cè)試劑盒(熒光PCR-毛細(xì)管電泳法，北京閱微基因技術(shù))檢測(cè)FMRl基因的CGG重復(fù)次數(shù)。按試劑盒的說(shuō)明操作，主要步驟如下：(1)建立PCR擴(kuò)增體系：15 μl全長(zhǎng)擴(kuò)增體系，包括擴(kuò)增緩沖液11.5 μl、全長(zhǎng)擴(kuò)增引物0.6 μl、酶混合液0.3 μl、無(wú)核酸酶純水1.6 μl，充分混勻后加入待檢測(cè)1 μl DNA樣本；15 μl重復(fù)擴(kuò)增體系，包括擴(kuò)增緩沖液11.5 μl、重復(fù)擴(kuò)增引物0.6 μl、酶混合液0.3 μl、無(wú)核酸酶純水1.6 μl，充分混勻后加入待檢測(cè)1 μl DNA樣本。(2)PCR反應(yīng)條件：兩種PCR擴(kuò)增體系的反應(yīng)條件相同，均為95℃ 5 min，97℃ 35 s、65℃ 35 s(在此步驟中，每1個(gè)循環(huán)減1℃)、68℃ 4 min共10個(gè)循環(huán)；然后接97℃ 35 s、62℃ 35 s、68℃ 4 min(在此步驟中，每1個(gè)循環(huán)增加20 s)，共20個(gè)循環(huán)；68℃ 10 min后，連接15℃完成擴(kuò)增反應(yīng)。(3)毛細(xì)管電泳：HiDi Formanmide(ABI，美國(guó))8.7 μl、QD1200(ABI，美國(guó))0.3 μl、PCR產(chǎn)物1 μl配制電泳檢測(cè)樣品，使用POP7膠(ABI，美國(guó))在Applied Biosystems 3500xl DNA測(cè)序儀(ABI，美國(guó))上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。選擇“Fragment”電泳方法，具體操作按使用說(shuō)明書(shū)。

3.結(jié)果分析：檢測(cè)數(shù)據(jù)使用GeneMapper分析軟件(ABI，美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。具體操作步驟參考GeneMapper分析軟件用戶(hù)使用手冊(cè)。采用目前國(guó)內(nèi)外普遍采用的分類(lèi)：(1)正常重復(fù)范圍(n=5～44)；(2)中間型(n=45～54)；(3)前突變(n=55～200)；(4)全突變(n>200)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在同一個(gè)體中FMRl的兩個(gè)等位基因(CGG)重復(fù)次數(shù)相對(duì)少者定義為allele-1，相對(duì)多者定義為allele-2，取allele-2的重復(fù)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；比較兩個(gè)隊(duì)列之間的顯著性水平，采用Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般情況

研究組共納入不明原因RSA患者340例，平均年齡(32.5±3.2)歲，平均流產(chǎn)次數(shù)(2.51±0.53)次。其中，流產(chǎn)2、3、4、5次的患者分別有206例(60.60%)、100例(29.40%)、30例(8.82%)和4例(1.18%)。對(duì)照組340例，平均年齡(32.3±3.3)歲。兩組病例年齡比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

二、兩組CGG重復(fù)序列數(shù)比較

研究組CGG重復(fù)序列數(shù)范圍為15～70次，平均(29.29±5.31)次。共30種不同的CGG重復(fù)數(shù)，頻率最大的重復(fù)次數(shù)為29次(41.5%)，其次為30次(38.8%)、36次(8.2%)。

對(duì)照組CGG重復(fù)序列數(shù)范圍為17～48次，平均(28.88±5.97)次。共29種不同的CGG重復(fù)數(shù)，頻率最大的重復(fù)次數(shù)為29次(43.2%)，其次為30次(42.6%)、31次(2.9%)。

兩組間CGG重復(fù)序列數(shù)比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組FMRl基因CGG重復(fù)序列分布比較[n(%)]

三、兩組CGG重復(fù)序列分型比較

兩組均無(wú)全突變型攜帶者。研究組FMRl基因中間型患者8例(2.35%)，對(duì)照組FMRl基因中間型1例1/340(0.29%)，組間比較有顯著差異(P<0.05)；研究組FMRl基因前突變患者2例(0.59%)，對(duì)照組無(wú)FMRl基因前突變攜帶者，組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；研究組中CGG重復(fù)≥35次的正常等位基因患者35例(10.29%)，對(duì)照組12例(3.53%)，組間比較有顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 研究組與對(duì)照組CGG重復(fù)序列數(shù)比較[n(%)]

討 論

文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)MR1基因前突變與卵巢早衰顯著相關(guān)，前突變攜帶者卵巢早衰(POF)發(fā)病率高達(dá)13%，自然絕經(jīng)時(shí)間較早，與卵巢儲(chǔ)備功能相關(guān)的指標(biāo)如血清抗苗勒管激素(AMH)、基礎(chǔ)FSH水平等出現(xiàn)異常[4-5]。而且有學(xué)者指出，卵巢儲(chǔ)備功能減退相關(guān)的卵母細(xì)胞特異性基因與RSA相關(guān)，并提出在不明原因的RSA患者中進(jìn)行上述相關(guān)基因的檢測(cè)[6]。因此，我們推測(cè)FMR1基因在RSA中亦發(fā)揮作用。

最近，國(guó)內(nèi)外數(shù)篇文獻(xiàn)報(bào)道了FMR1基因CGG重復(fù)序列多態(tài)性與反復(fù)流產(chǎn)之間的關(guān)系。希臘一項(xiàng)前瞻性病例對(duì)照研究，對(duì)49名≤40歲的不明原因RSA女性及49例年齡匹配的正常女性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CGG重復(fù)次數(shù)存在顯著差異(P=0.027)，流產(chǎn)患者前突變攜帶風(fēng)險(xiǎn)顯著高于正常對(duì)照組(OR=4.267)[7]。印度Dean等[8]研究顯示，與對(duì)照組相比，RSA組中間型等位基因攜帶者頻率更高(5/100 vs.2/100)；此外，RSA組CGG重復(fù)數(shù)≥35個(gè)的正常等位基因的比例更高(24/200 vs.8/200)，單純CGG重復(fù)序列(無(wú)AGG嵌入)的比例顯著增加(15/200 vs.3/200，P=0.006)。這種單純CGG重復(fù)序列數(shù)在下一代中易發(fā)生增加，可能具有導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)的致病性后果。國(guó)內(nèi)陳蔚琳等[9]進(jìn)行的全國(guó)多中心橫斷面研究顯示，反復(fù)生育失敗婦女的FMRl基因前突變攜帶者發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高，為1/369。針對(duì)中國(guó)北方育齡期婦女的研究顯示，具有自然流產(chǎn)史或因胚胎發(fā)育遲緩而人工流產(chǎn)史女性的前突變攜帶率為1/320，高于無(wú)流產(chǎn)史女性的1/756[10]。馮旺琴等[11]研究發(fā)現(xiàn)，早期自然流產(chǎn)患者FMRl基因中間型攜帶率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(1/222 vs.1/247)，但前突變攜帶率顯著高于對(duì)照組(1/400 vs.1/740，P<0.05)。但本研究發(fā)現(xiàn)，不明原因RSA患者FMR1基因的中間型和正常范圍內(nèi)的高CGG重復(fù)序列數(shù)攜帶比例均顯著高于對(duì)照組，而前突變攜帶率并未顯著增加，這與國(guó)內(nèi)馮旺琴等[11]研究結(jié)果不同，但與Dean等[8]的研究結(jié)果相似。分析可能的原因：一方面可能是本研究的樣本量太小，導(dǎo)致了數(shù)據(jù)偏倚；此外，受試者的遺傳背景可能存在一定的地區(qū)差異；再者，受試者納入/排除標(biāo)準(zhǔn)有所差異。本研究的入組標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格，且最大年齡較馮旺琴等[11]研究更小，以最大限度減少因卵巢老化導(dǎo)致的流產(chǎn)患者；而且流產(chǎn)孕周截止時(shí)間為孕20周以?xún)?nèi)，而馮旺琴等[11]研究的受試者均為孕早期(孕5～12周)RSA患者。上述差異可能導(dǎo)致了兩項(xiàng)研究結(jié)果的不一致。對(duì)于我國(guó)不明原因RSA患者的FMR1基因CGG重復(fù)序列分型特點(diǎn)，尤其與不明原因RSA的相關(guān)性還有待更多更大樣本量的、設(shè)計(jì)更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯坑枰躁U明。

回顧文獻(xiàn)，F(xiàn)MR1中間型等位基因與生育力降低、月經(jīng)不規(guī)則、更年期提前、原發(fā)性卵巢功能不全(POI)、非整倍體發(fā)生率更高以及流產(chǎn)相關(guān)[8]。在POI和卵巢儲(chǔ)備功能降低患者中，較大的正常等位基因重復(fù)頻率增加[12]。Kline等[13]的研究顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)MR1基因CGG重復(fù)序列數(shù)增多在三體性自然流產(chǎn)的婦女中所占比例更高。Kline等[13]曾推測(cè)流產(chǎn)的增加可能與卵巢卵母細(xì)胞池的減少有關(guān)，F(xiàn)MRl基因的前突變攜帶者，卵巢儲(chǔ)備功能下降，二者之間可能存在某種關(guān)聯(lián)[14-16]。中間型和較大的正常型FMR1等位基因很可能導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備減少，在這種情況下，受損的卵母細(xì)胞質(zhì)量最終可能導(dǎo)致致命的遺傳缺陷，如非整倍體，從而導(dǎo)致流產(chǎn)。這一假設(shè)得到了如下研究結(jié)果的支持：CGG重復(fù)次數(shù)大于30次的女性卵巢儲(chǔ)備減少，AMH和FSH水平等卵巢功能參數(shù)異常[17-18]。研究證實(shí)，血清AMH水平的降低和血清FSH水平的升高與流產(chǎn)相關(guān)，從而提供了中間型和較大的正常型FMR1等位基因與RSA相關(guān)的證據(jù)[8]。

2013年Banerjee等[19]觀(guān)察到，在不明原因RSA患者中，PGE2的表達(dá)顯著增加。脆性X智力障礙相關(guān)蛋白1(FXR1)是脆性X智力低下綜合征蛋白(FMRP)的同源物，與FXR2結(jié)合形成RNA結(jié)合蛋白的FXR家族[20]。FXR蛋白靶向RNA結(jié)合域[21]具有與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用(可能包括mRNA核質(zhì)穿梭以及翻譯)相一致的特征[22]。2019年最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR1敲除可促進(jìn)原代細(xì)胞滋養(yǎng)層中PGE2的產(chǎn)生。這些結(jié)果提示FXR1參與RSA的發(fā)病機(jī)制。FXR1可能是一種新的COX-2調(diào)節(jié)因子。與健康對(duì)照組相比，RSA患者的滋養(yǎng)層FXR1 mRNA表達(dá)水平顯著降低，COX-2 mRNA表達(dá)水平升高。因此，F(xiàn)XR1在早孕中起著關(guān)鍵作用，可能是RSA的潛在治療靶點(diǎn)[23]。

本研究的主要局限性在于我們沒(méi)有分析病例組和對(duì)照組的AMH和FSH水平。因此，需要進(jìn)一步的前瞻性研究來(lái)證實(shí)FMR1基因CGG重復(fù)序列與反復(fù)妊娠丟失之間的可能聯(lián)系，并揭示相關(guān)的分子機(jī)制。

綜上，我們檢測(cè)了不明原因RSA女性中FMR1基因CGG重復(fù)序列數(shù)的分布情況。結(jié)果表明，較大的正常型以及中間型FMR1等位基因可能在不明原因的RSA中發(fā)揮作用。未來(lái)還需要對(duì)此進(jìn)行更多的研究，以揭示其分子機(jī)制。