曹亞男，李佳銀，羅玲麗，李跑，劉霞

（湖南農業(yè)大學食品科學技術學院食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）是一類腺嘌呤型細胞分裂素，也是第一個人工合成的外源性植物激素[1]。它不僅能夠抑制根的生長，也常用于增大果實，提高作物品質，延長保鮮期和縮短生長周期[2]。

近年研究顯示，6-BA 的過度使用極有可能抑制水產生物的生長或造成胚胎發(fā)育畸形，并且在環(huán)境和果蔬中的殘留會刺激人體皮膚黏膜，造成胃黏膜損傷等癥狀[3]。因此，各國相繼規(guī)定了果蔬中6-BA 的最大殘留限量。2017 年加拿大將6-BA 的最高殘留量限制在0.1 mg/kg，同年美國也確定了對瓜果類果實中6-BA 殘留量的耐受性為0.01 mg/kg。2015 年，我國禁止在豆芽生產中使用6-BA[4]。在GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中，明確規(guī)定6-BA 不得作為食品加工助劑在生產和經營中使用。

檢測6-BA 的主要方法有分光光度法[5]、酶聯免疫法（enzyme-linked immunoassay，ELISA）[6]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[7]和高效液相色譜法或液-質聯用法（high-performance liquid chromatography/highperformance liquid chromatography mass spectrometry，HPLC/HPLC-MS）[8]。分光光度法易受到樣品中色素的干擾而導致檢測不夠準確。ELISA 法特異性強但靈敏度有限。GC 法測定6-BA，一般需要進行衍生化。HPLC是目前應用最為廣泛的檢測6-BA 方法，具有準確、靈敏的特點。然而，蔬菜樣品基質復雜，且6-BA 在蔬菜中殘留濃度低，屬于痕量檢測，故在檢測之前，通常需要對蔬菜中的6-BA 進行富集分離，以確保檢測的準確性和靈敏性。應用較為廣泛的樣品前處理方法有固相萃取[9]、液液萃取[10]、分散液-液微萃取[11]以及微波輔助萃取[12]，這些方法操作簡便，但均不能很好地選擇性分離目標物質，且耗時長，需要消耗大量的有機溶劑。因此，發(fā)展特異性富集分離方法，使6-BA 從復雜的食品基質中分離出來，同時排除基質的干擾，對實現6-BA 準確、高靈敏的檢測至關重要。

分子印跡技術是采用人工方法，針對待測分子（模板分子）所帶的官能團和空間結構，利用有機化合物（功能單體）和交聯劑的物理和化學性質制備與待測分子專一性結合，含有特定空間結構孔穴的分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）的技術[13-14]，具有量身定做、制備簡單，穩(wěn)定且可反復使用的優(yōu)勢[15]。在此基礎上發(fā)展的磁性分子印跡納米粒子（magnetic molecularly imprinted nanoparticles，MMIP NPs），是一種方便有效，可通過外部磁場對待測物選擇性富集分離的材料。由于其識別位點，是建立在磁納米粒子的表面或靠近表面的位置，能夠實現待測物的快速吸附和洗脫。故將其應用于待測物的富集分離，不僅操作簡單，也可大大節(jié)省樣品預處理的時間[16-17]。

功能單體是MIP 形成的關鍵，其作用是提供官能團，使之與模板分子形成復合物，故功能單體和模板分子之間的作用力，直接決定了MIP 的性能[18]。目前制備的MIP，大多數使用一種功能單體。但近年也有研究表明，利用復合功能單體制備的MIP 材料，比單一功能單體材料的吸附能力和特異性識別能力均有明顯提高。如饒維等[19]團隊采用β-環(huán)糊精和4-乙烯基吡啶作為復合功能單體，雙酚A 作為模板分子，乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）作為交聯劑，合成了MMIP NPs。并對水樣中的雙酚A進行提取，發(fā)現其吸附容量（48 mg/g）高，受干擾物影響小，富集更為高效（回收率：90.51%～98.21%）。廖素蘭等[20]以甲基丙烯酸和丙烯酰胺為復合功能單體，制備奧硝唑類抗生素的MMIP NPs，吸附容量（6.789 μmol/g）比單獨使用MAA 制備的MMIP NPs（2.494 μmol/g）要高，檢測河水樣品中硝基咪唑的回收率可達85.4%～104.3%。

本文采用表面印跡技術，以羧基化的Fe3O4NPs 為載體，6-BA 為模板分子，甲基丙烯酸（α-methylacrylic acid，MAA）和對苯乙烯磺酸鈉（sodium 4-vinylbenzenesulfonate，SSS）為復合功能單體，EGDMA 作為交聯劑，偶氮二異丁腈（2，2-azobisisobutyronitrile，AIBN）為引發(fā)劑，制備了6-BA 磁性分子印跡納米粒子（magnetic molecular imprints nanoparticles，MMIPs NPs1），優(yōu)化了富集分離的相關條件，并與僅采用MAA 為功能單體制備的MMIPs NPs2在吸附性能方面做了對比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亞鐵（FeCl2·4H2O）、氫氧化鈉、檸檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、6-糠氨基腺嘌呤（kinetin，6-KT）、α-萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）、無水乙醇、甲醇、乙酸：國藥集團化學試劑有限公司；6-BA：上海瑞永生物科技有限公司；MAA、SSS、AIBN：上海麥克林生化科技有限公司；EGDMA：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計（LAMBDA-365）：美國珀金埃爾默公司；超聲波清洗儀（KQ-100）：昆山市超聲儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器（HY-200D）：天津歐諾儀器有限公司；真空干燥箱（DZF-6030A）：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羧基化Fe3O4NPs 的制備

采用化學共沉淀法制備表面羧基化的Fe3O4NPs[21]，將制備得到的產物借助外加磁場進行分離，用去離子水反復洗滌至中性，并于60 ℃條件下真空干燥，作為后續(xù)制備MMIPs NPs 的載體。

1.3.2 MMIPs NPs1制備條件的優(yōu)化

1.3.2.1 6-BA 檢測波長的確定

分別對6-BA、MAA、SSS、EGDMA 和AIBN，掃描其紫外光譜，確定檢測6-BA 的最佳波長。

1.3.2.2 MMIPs NPs1和MMIPs NPs2的制備方法

將0.113 g 6-BA 與10 mL 去離子水和乙醇的混合溶液（9∶1，體積比），以及0.15 mL MAA 和0.106 g SSS混合，攪拌30 min，從而得到預組裝溶液。取Fe3O4磁納米粒子0.25 g，加入預組裝溶液中，再加入10 mmol EGDMA，超聲處理30 min，獲得預聚合溶液。將預聚合溶液加入到含有0.2 g PVP 核殼催化劑的50 mL 乙醇中，再加入0.05 g AIBN，通N2除O2，在轉速360 r/min，溫度60 ℃，反應12 h。然后應用外加磁場將聚合物分離，得到的聚合物用甲醇-乙酸溶液（9∶1，體積比）洗滌數次，直到洗滌液中檢測不到6-BA，再真空干燥（60 ℃）24 h 后得到MMIPs NPs1。

MMIPs NPs2制備只使用MAA 為功能單體，其余步驟均與MMIPs NPs1相同。

1.3.2.3 6-BA 洗脫液的確定

根據1.3.2.2，分別采用體積比為9∶1、8∶2 甲醇-乙酸混合溶液、體積比9∶1 的乙腈-乙酸混合溶液，超聲洗滌MMIPs NPs1數次，取上清液，依據最佳檢測波長處的吸光度值，考察其洗脫效果，確定最佳洗脫液。

1.3.2.4 MMIPs NPs1對6-BA 的吸附試驗

準確稱取2 mg MMIPs NPs1至5 mL 離心管中，向其中加入4 mL 0.02 μg/mL 的6-BA 溶液，25 ℃恒溫振蕩12 h，經磁鐵分離后，取上清液過0.22 μm 濾膜，在最佳檢測波長處測定其吸光度值，每個樣本平行3次。根據MMIPs NPs1對6-BA 的吸附容量Q 及吸附效率，確定制備MMIPs NPs1的最佳條件，計算公式如下。

式中：C0為6-BA 的初始濃度，mg/mL；Cs為上清液中6-BA 的濃度，mg/mL；V 為溶液的體積，mL；m 為MMIPs NPs1的質量，g。

1.3.2.5 MAA 與SSS 比例的確定

根據1.3.2.2，固定羧基化Fe3O4NPs 的添加量，6-BA、EGDMA 的比例，在相同的合成條件下，改變MAA 與SSS 的添加比例（物質的量之比1∶3、2∶2、3∶1、4∶1），確定MAA 與SSS 的最優(yōu)比例。

1.3.2.6 羧基化Fe3O4NPs 添加量的確定

根據1.3.2.2，固定6-BA、MAA、SSS 的比例，在相同條件下，改變羧基化Fe3O4NPs 的添加量（0.15、0.25、0.35、0.45 g），確定其最適合添加量。

1.3.3 MMIPs NPs1富集分離6-BA

1.3.3.1 MMIPs NPs1添加量對吸附效率的影響

分別準確稱取2、4、6、8、10、12、14、16 mg 最優(yōu)條件下制備的MMIPs NPs1至5 mL 離心管中，每管各加入4 mL 20 μg/mL 的6-BA 溶液（pH 6），25 ℃恒溫振蕩12 h，經磁鐵分離后，取上清液過0.22 μm 濾膜，在最佳檢測波長處測定吸光度值，計算其吸附效率，每個樣本平行測定3 次，考察MMIPs NPs、添加量對6-BA吸附效率的影響。

1.3.3.2 吸附方式對吸附效率的影響

準確稱取12 mg MMIPs NPs1至5 mL 離心管中，每管各加入4 mL 20 μg/mL 的6-BA 溶液（pH 6），25 ℃分別以搖床振蕩和靜置2 種方式吸附6 h，經磁鐵分離后，取上清液過0.22 μm 濾膜，在最佳檢測波長處測定吸光度值，計算其吸附效率，每個樣本平行3 次，考察吸附方式對6-BA 吸附效率的影響。

1.3.3.3 pH 值對吸附效果的影響

分別準確稱取最優(yōu)條件下制備的2 mg MMIPs NPs1至5 mL 離心管中，每管各加入4 mL pH 值為4、6、8、10的6-BA 標準溶液，25 ℃恒溫吸附12 h，經磁鐵分離后，取上清液過0.22 μm 濾膜，在最佳檢測波長處測定吸光度值，計算其吸附容量，每個樣本平行3 次，考察吸附pH 值對6-BA 吸附容量的影響。

1.3.4 選擇性試驗

以6-KT 為結構類似物，NAA 為非結構類似物考察MMIPs NPs1的選擇性，并與MMIPs NPs2作對比。分別準確稱取1 mg MMIPs NPs1或MMIPs NPs2于離心管中，再加入4 mL 30 μg/mL 分析物標準溶液，靜置吸附12 h，磁鐵分離后去上清液，在最佳檢測波長處測定吸光度值，計算其吸附容量和選擇性因子（selectivity factor，SF），每個樣本平行3 次，考察MMIPs NPs1的特異性。

使用選擇性因子（SF）評估MMIPs NPs1選擇特異性，其計算公式如下。

式中：Q模板分子為模板分子的吸附容量，mg/g；Q非模板分子為非模板分子的吸附容量，mg/g。

1.3.5 實際樣品的加標回收率試驗

10 g 黃瓜樣品搗碎并與20 mL 甲醇混合后，超聲15 min，再離心（4 000 r/min）15 min。然后將上清液轉移至50 mL 離心管中。殘渣用20 mL 甲醇超聲15 min，合并兩部分上清液。取經上述處理后的樣品提取液，分別加入6-BA 標準品，使其終濃度為5、10、20 μg/mL作為加標樣品。取加標樣品4 mL 與MMIPs NPs（112mg）在25℃下靜置吸附60 min。磁鐵分離后，將MMIPs NPs1用甲醇-乙酸混合液（9∶1，體積比）充分洗脫，收集的洗脫液，應用紫外-可見光度計測定6-BA。每個濃度平行檢測3 次，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 6-BA 檢測波長的確定

MAA、SSS、EGDMA、AIBN 以及6-BA 的紫外光譜見圖1。

圖1 MAA、SSS、EGDMA、AIBN 以及6-BA 的紫外光譜Fig.1 UV spectra of MAA，SSS，EGDMA，AIBN and 6-BA

由圖1 可明顯看出，6-BA、SSS 和AIBN 的最大紫外吸收波長分別為270、255、346 nm，且其它物質均不影響6-BA 的最大紫外吸收峰，故6-BA 最佳檢測波長為270 nm。

2.2 模板分子洗脫液的確定

MIP 合成后，采用合適的洗脫液，可將模板分子洗脫下來，使得形成的特異性孔穴暴露出來。常規(guī)的洗脫液為甲醇或乙腈等有機溶液，有研究表明[22]，在有機溶劑中添加一定量的乙酸溶液，既可增加試劑的洗脫能力，也可減少對孔穴的破壞，達到更好的洗脫效果。不同比例洗脫液對模板分子的洗脫效果見圖2。

圖2 不同比例洗脫液對MMIPs NPs 洗脫效果的紫外光譜Fig.2 UV spectra of MMIPs NPs eluted with eluents of different ratios

如圖2 所示，初次洗脫時，甲醇-乙酸溶液（9∶1，體積比）的洗脫效果較優(yōu)于乙腈-乙酸溶液（9∶1，體積比和甲醇-乙酸溶液（8∶2，體積比）；隨著洗脫次數的增加，甲醇-乙酸溶液（9∶1，體積比）的洗脫效果均遠遠高于其余兩種洗脫液，故選擇甲醇-乙酸溶液（9∶1，體積比）作為模板分子的洗脫液。

2.3 MAA 與SSS 比例的確定

一般采用單個功能單體制備的MIP，存在選擇性差和吸附能力不高等缺點，而采用兩種或兩種以上的化合物作為功能單體，能與模板分子形成多個不同類型的識別位點，可有效地提高分子印跡的吸附能力和特異性[23]。故本研究優(yōu)化了MAA 與SSS 的摩爾質量之比，結果如圖3 所示。

圖3 不同比例MAA 與SSS 制備MMIPs NPs1 的吸附性能Fig.3 Adsorption properties of MMIPs NPs1 prepared by different ratio of MAA and SSS

由圖3 可看出，MMIPsNPs1對6-BA 的吸附容量，隨著時間的增加始終為QMAA∶SSS=3∶1>QMAA∶SSS=2 ∶2>QMAA∶SSS=1 ∶3>QMAA∶SSS=4∶1。且隨著時間的延長，吸附容量逐漸增加。吸附50 min 后，達到平衡，說明MAA ∶SSS 為3 ∶1 時，制備的MMIPs NPs1的吸附效果最優(yōu)。

2.4 羧基化Fe3O4 NPs 添加量的確定

磁性載體作為一種重要的表面印跡材料，其添加量直接影響了MMIPs NPs1的吸附性能和分離效率，不同羧基化Fe3O4NPs 添加量制備MMIPs NPs1的吸附性能見圖4。

圖4 不同羧基化Fe3O4 NPs 添加量制備MMIPs NPs1 的吸附性能Fig.4 Adsorption properties of MMIPs NPs1 prepared by different additions of carboxyl-modified Fe3O4 NPs

如圖4 所示，隨著羧基化Fe3O4NPs 添加量的增加，MMIPs NPs1對6-BA 的吸附容量也隨之增加，當羧基化Fe3O4NPs 添加量為0.25 g 時，吸附容量達到最大（16.07 mg/g），再增加羧基化Fe3O4NPs 的添加量，吸附容量有所下降，故選擇羧基化Fe3O4NPs 的最優(yōu)添加量為0.25 g。

2.5 MMIPs NPs1 添加量對吸附效率的影響

不同MMIPs NPs1添加量對6-BA 吸附效率的影響見圖5。

圖5 不同MMIPs NPs1 添加量對6-BA 吸附效率的影響Fig.5 Effect of MMIPs NPs1 on the adsorption efficiency of 6-BA

如圖5 所示，隨著MMIPs NPs1添加量的增加，其吸附效率也隨之增加。當MMIPsNPs1的添加量為12mg時，吸附效率達到94.18%，繼續(xù)增加MMIPs NPs1添加量，吸附效率不再有明顯的增加。故選擇MMIPs NPs1的添加量為12 mg 進行下一步試驗。

2.6 吸附方式對吸附效率的影響

不同吸附方式對6-BA 吸附效率的影響見圖6。

圖6 不同吸附方式對6-BA 吸附效率的影響Fig.6 Effect of different adsorption methods on 6-BA adsorption efficiency

如圖6 所示，搖床與靜置對6-BA 吸附效率的平均值分別為80.71%和82.28%，說明靜置吸附的效果好，這可能是搖床吸附時產生的振動，對MMIPs NPs1與6-BA 的結合產生了一定的阻力，使得其吸附效率小于靜置的吸附效率。且靜置吸附也可節(jié)省能源，故后續(xù)試驗選擇靜置的吸附方式。

2.7 pH 值對吸附效果的影響

溶液的pH 值對吸附效果的影響見圖7。

圖7 吸附溶液pH 值對6-BA 吸附的影響Fig.7 Effect of pH of adsorption solution on 6-BA adsorption

如圖7 所示，MMIPs NPs1對6-BA 的吸附容量隨著6-BA 濃度的增加而不斷增加，且始終為QpH=6>QpH=4>QpH=8>QpH=10。故溶液pH 值為6 時，吸附效果最佳，吸附容量最大達到26.37 mg/g。這是因為MMIPs NPs1對6-BA 的吸附主要是靠氫鍵的作用力，強酸情況下會破壞他們之間的作用力而使得吸附能力下降；隨著堿性的增強，MAA 的羧基和SSS 的磺酸基被破壞，也易導致其吸附能力下降[24-25]。故當吸附溶液pH 值為6時，吸附效果最優(yōu)。

2.8 選擇性試驗

圖8 顯示了6-BA、6-KT、NAA 的分子結構。

圖8 6-BA、6-KT 和NAA 化學結構Fig.8 The chemical structure of 6-BA，6-KT and NAA

MMIPs NPs1與MMIPs NPs2選擇性的比較結果見表1。

表1 MMIPs NPs1 與MMIPs NPs2 選擇性的比較Table 1 Comparison of selectivity between MMIPs NPs1 and MMIPs NPs2

如表1 所示，MMIPs NPs1對6-BA 的吸附容量為37.635 mg/g，高于MMIPs NPs2的吸附容量（31.288 mg/g），這可能是由于MMIPs NPs1具有多個識別位點，從而能準確地識別并吸附6-BA。MMIPs NPs1和MMIPs NPs2均對6-KT 和NAA 表現出非特異性吸附，但MMIPs NPs1對6-KT 和NAA 的吸附容量僅為7.982 mg/g 和4.493 mg/g，SF 值分別為4.715 和8.387，遠 遠低于MMIPs NPs2對6-KT 和NAA 的吸附。以上結果表明，基于雙功能單體制備的MMIPs NPs1比基于單功能單體制備的MMIPs NPs2，具有更高的吸附容量，能夠更加準確的識別目標分子。

2.9 前處理方法的比較

應用制備的MMIPs NPs1對黃瓜中的6-BA 富集分離后，采用紫外-可見光度計對其進行檢測，并與文獻中采用不同前處理方法的6-BA 殘留檢測結果進行比較見表2。

由表2 可看出，本方法所制備的吸附材料吸附容量最大，選擇性更好，且檢測結果的準確性符合要求。

表2 前處理方法之間的比較Table2 Comparison between pretreatment methods

3 結論

本文采用雙功能單體的表面分子印跡合成策略，成功制備了對6-BA 具有特異性識別的MMIPs NPs1。當MMIPs NPs1的添加量為12 mg，靜置吸附50 min時，其吸附效率可達94.18%。與單一功能單體合成的MMIPs NPs2相比，其吸附容量與選擇性均有明顯優(yōu)勢。對比其它前處理方法，MMIPs NPs1兼具吸附特異性和磁性，能有效地減少食品樣品中雜質的干擾，快速富集分離6-BA，進而提高6-BA 檢測的準確性和靈敏性，且制備MMIPs NPs1的成本低。故本研究所制備的MMIPs NPs1，可用作蔬菜中6-BA 的固相萃取劑。MMIPs NPs 對于6-BA 的吸附效果與所用的功能單體結構密切相關，同時也受實際樣品基質的影響，而目前功能單體的種類較少，含有的基團相對單一，故應開發(fā)更多的功能單體以供選擇，以期獲得吸附容量和識別特異性更佳的MMIPs NPs。此外，由于樣品的基質直接影響了MMIPs NPs1對6-BA 的吸附效率和吸附時間，本課題組將繼續(xù)深入探討采用MMIPs NPs1對不同種蔬菜中6-BA 富集分離的最佳條件，使其吸附效率更高，吸附時間更短，為食品中待測物的富集分離提供有力的技術支撐。