楊雪梅，趙建銳，劉瑩亮，李家華*

（1.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院，云南普洱665000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南昆明650201）

普洱生茶是在普洱茶地理標(biāo)志規(guī)定范圍內(nèi)以云南大葉種茶鮮葉為原料，經(jīng)殺青、揉捻、日光干燥、蒸壓成型等工藝制成的緊壓茶，其品質(zhì)特征為：外形色澤墨綠、香氣清純持久、滋味濃厚回甘、湯色綠黃清亮，葉底肥厚黃綠[1]。大量研究證實普洱生茶具有多種保健功能，如降血脂、預(yù)防心血管疾病、抗癌抗突變、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善動脈粥樣硬化等[2-3]。普洱生茶與其它茶類相比，具有耐儲存特點，且隨著儲存時間的推移，其主要生化成分發(fā)生轉(zhuǎn)化而使其品質(zhì)得到提高，從而使普洱生茶具備較高的品飲價值[4]。普洱生茶的儲存年限是品質(zhì)好壞的一個重要指標(biāo)，也是普洱生茶研究領(lǐng)域的一個難點[5]。經(jīng)過長時間的儲存（10 年或者10 年以上），其滋味和香氣可達(dá)最佳[6-7]。在自然儲存過程中，生茶中內(nèi)含成分含量會發(fā)生變化，此外，由于茶葉的自動氧化作用，導(dǎo)致生茶主要生化成分的變化趨勢和熟茶的后發(fā)酵過程中成分變化走向較相似。

相關(guān)研究證實普洱茶具有顯著的降脂減肥、抗脂質(zhì)過氧化、抗衰老等生理功能[8-10]。近年來，隨著對普洱茶生物活性以及功效研究的不斷深入，世界各國已經(jīng)認(rèn)識到普洱茶的多重功效，其中抗氧化性是多種保健作用的基礎(chǔ)。但是目前學(xué)者主要展開的研究是針對不同類型茶葉抗氧化功能的比較分析[11-13]。在普洱茶的研究領(lǐng)域中，主要開展的是對不同發(fā)酵程度普洱熟茶抗氧化活性的測定[14-16]。本文對不同儲存年份的普洱生茶體外抗氧化活性與生化成分的相關(guān)性進(jìn)行研究。旨在為普洱茶生產(chǎn)企業(yè)和普洱茶愛好者正確儲存或收藏普洱茶提供數(shù)據(jù)支撐，為消費者合理、正確選擇普洱茶產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樣：云南雙江勐庫茶葉有限責(zé)任公司，相同等級標(biāo)準(zhǔn)、相同存放地、不同儲存年份（2006 年～2015 年）的普洱生茶標(biāo)準(zhǔn)樣品為試驗茶樣，規(guī)格為357 g。

（+）-兒茶素[（+）-catechin，C]、表兒茶素[epicatechin，EC]、表沒食子兒茶素[epigallocatechin，EGC]、表兒茶素沒食子酸酯[epicatechin gallate，ECG]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[epigallocatechin gallate，EGCG]：維克奇生物科技有限公司；VC：德國DRE 公司；DPPH：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒、羥基自由基清除能力測試試劑盒：南京建成生物工程研究所。以上試劑均為分析純。甲醇、乙腈（色譜純）：美國安捷倫有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

X-5 紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；12C00 型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；HHS 型恒溫水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；BS110 s 電子分析天平：德國Sartorius 儀器公司；ZMQS5001 型純水儀：美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 不同年份普洱生茶水提物的制備

準(zhǔn)確稱取磨碎試樣3 g；加450 mL 沸水，在沸水浴中浸提45 min，每一個樣品設(shè)立3 個平行，每隔10 min搖瓶一次，過濾。洗滌殘渣，濾液合并于500 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，備用。

1.3.2 水提物生化成分測定

茶多酚的測定方法：采用GB/T 8313—2002《茶茶多酚的測定》中的酒石酸亞鐵比色法測定。

游離氨基酸的測定方法：采用GB/T 8314—2002《茶游離氨基酸總量測定》中的茚三酮比色法測定。

兒茶素、咖啡堿的測定方法：高效液相色譜法[17]。

含水量的測定方法：快速法[18]。

水浸出物的測定方法：采用GB/T 8305—2002《茶水浸出物測定》中的沸水萃取法測定。

1.3.3 體外抗氧化活性測定

將不同儲存年份的普洱生茶水提物稀釋為（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg 干茶/mL），待用。

稱取0.1 g VC用超純水溶于100 mL 容量瓶中，定容搖勻后稀釋VC溶液到不同濃度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），待用。

1.3.3.1 DPPH 自由基清除能力測定

取一定量（4.0 mg）的DPPH，用無水乙醇（100 mL）配制成0.04 mg/mL 的DPPH 溶液。分別取2 mL 不同濃度梯度的茶湯待測液，再加入2 mL 的DPPH 溶液混合均勻，暗反應(yīng)15 min。用VC作為陽性對照，無水乙醇作空白對照，取上清液于517 nm 處測吸光值。DPPH自由基清除率/%=[1-（A樣品-A空白）/A對照]×100

1.3.3.2 總抗氧化能力測定（T-AOC）

按照T-AOC 試劑盒加樣表嚴(yán)格加樣，以VC為陽性對照，取樣量為1 mL。

總抗氧化能力/（U/mg）=[（測定OD 值-對照OD 值）÷0.01]÷30×（反應(yīng)液總量÷取樣量）÷待測樣本濃度

1.3.3.3 羥基自由基清除率的測定

按照羥基自由基清除能力測試試劑盒加樣表嚴(yán)格加樣。以VC為陽性對照，取樣量為0.2 mL。

羥基自由基清除能力/（U/mg）=[（對照管OD 值-測定OD 值）÷（標(biāo)準(zhǔn)管OD 值-空白管OD 值）]×標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度÷（待測樣本濃度×取樣量）

1.3.3.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定

1）取5 mL Tris-HCl 加入0.5 mL 樣本溶液，混合均勻后25 ℃下預(yù)熱20 min；然后加入鄰苯三酚0.5 mL，在25 ℃下繼續(xù)保持4 min，加0.5 mL 濃鹽酸終止反應(yīng)。在325 nm 波長處測吸光值為Ai。

2）用0.5 mL 的去離子水代替1）中的0.5 mL 鄰苯三酚，其余操作同上，測其吸光值為Aj。

3）空白管：用0.5 mL 去離子水代替1）中的0.5 mL樣品溶液，吸光值為A0。

超氧陰離子自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）÷A0]×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用Excel 2016 和SPSS 64.0 軟件進(jìn)行處理；選擇Duncan’s 檢驗在p＜0.05 檢驗水平上對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。選擇Pearson 相關(guān)系數(shù)在p＜0.01 和p＜0.05 檢驗水平上對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析。所有數(shù)據(jù)均是3 次測試的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同儲存年份普洱生茶主要生化成分含量分析

不同儲存年份普洱生茶主要生化成分含量見表1。

由表1 可知，供試樣隨著儲存時間的增加含水量呈整體上增加的趨勢，茶多酚、氨基酸均隨儲存時間的增加呈整體下降趨勢。但供試樣水浸出物、咖啡堿含量變化與儲存年份的變化無規(guī)律可循。

不同儲存年份普洱生茶兒茶素各組分含量見表2。由表2 可知，不同儲存年份普洱生茶5 種主要兒茶素組分含量無變化規(guī)律。其中，EGCG 含量變幅為4.86%～7.12%，ECG 含量變幅為4.86%～6.34%，EGC 含量變幅為1.86%～2.98%，EC 含量變幅為1.22%～1.68%，C 含量變幅為0.58%～0.82%。與戚康標(biāo)等研究結(jié)果相一致[19]。造成這一現(xiàn)象的原因可能是供試樣在存放過程中，酯型兒茶素發(fā)生降解轉(zhuǎn)化成為簡單兒茶素，同時酯型兒茶素也會發(fā)生自動氧化，轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)，從而導(dǎo)致酯型兒茶素含量在兒茶素總量中的比例呈下降趨勢。

表1 不同儲存年份普洱生茶的主要生化成分含量Table 1 The contents of major biochemical components in nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years %

表2 不同儲存年份普洱生茶兒茶素各組分含量比較Table 2 Determination of catechins in nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years %

2.2 不同儲存年份普洱生茶體外抗氧化活性測定

2.2.1 DPPH 自由基的清除能力

研究以VC為陽性對照，測定了VC和不同儲存年份普洱生茶在不同濃度下對DPPH 自由基的清除能力，回歸方程和IC50值結(jié)果見表3。

表3 不同年份普洱生茶對DPPH 自由基的清除率Table 3 The clearance rate of DPPH radical of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years

從表3 可知，VC和不同儲存年份的普洱生茶水提物對DPPH 自由基均表現(xiàn)出顯著的清除效果，且量效呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2值均大于0.95。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，VC的IC50為0.135 mg/mL，10 個不同儲存年份普洱生茶的IC50值范圍為：0.515 mg/mL～1.243 mg/mL。即DPPH 自由基的清除能力強(qiáng)弱順序為：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007年生茶＞2006 年生茶。

2.2.2 超氧陰離子自由基的清除能力

圖1 是10 個不同儲存年份普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時對超氧陰離子自由基的清除率。

圖1 相同濃度不同儲存年份生茶對超氧陰離子自由基清除率Fig.1 The scavenging ratio of superoxidefree radical of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years in the same concentration

從圖1 可知，不同儲存年份的普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時，其對超氧陰離子自由基的清除率的變化范圍是：17.01%～69.60%，且隨儲存時間的增加而降低。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，當(dāng)VC清除率為17.01%和69.60%時，濃度分別為0.026 mg/mL 和0.23 mg/mL。即對超氧陰離子自由基的清除能力順序為：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007年生茶＞2006 年生茶。

2.2.3 羥基自由基的清除能力

圖2 是10 個不同儲存年份普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時對羥基自由基清除能力。

圖2 相同濃度不同儲存年份生茶對羥基自由基清除能力Fig.2 The scavenging activity of hydroxylfree radicals of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years in the same concentration

從圖2 可知，不同儲存年份的普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時，其對羥基自由基清除能力的變化范圍是：39.41 U/mg～48.15 U/mg，且隨儲存時間的增加而降低。即對羥基自由基清除能力順序為：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007年生茶＞2006 年生茶。

2.2.4 總抗氧化能力

圖3 是10 個不同儲存年份普洱生茶水提物為1.0 mg 干茶/mL 時的總抗氧化能力。

從圖3 可知，不同儲存年份的普洱生茶水提物濃度為1.0 mg 干茶/mL 時，其總抗氧化能力的變化范圍是：3.19 U/mg～7.88 U/mg，且隨儲存時間的增加而降低。即總抗氧化能力的強(qiáng)弱順序為：VC＞2015 年生茶＞2014 年生茶＞2013 年生茶＞2012 年生茶＞2011 年生茶＞2010 年生茶＞2009 年生茶＞2008 年生茶＞2007 年生茶＞2006 年生茶。

圖3 相同濃度不同儲存年份生茶的總抗氧化能力Fig.3 The total antioxidant capacity of of nonfermented Pu-erh tea samples with various storage years

不同儲存年份普洱生茶DPPH 自由基清除能力、超氧陰離子自由基的清除能力、羥基自由基清除能力、總抗氧化能力均隨儲存時間的延長而降低，其中超氧陰離子自由基的清除能力下降幅度最大，降幅達(dá)到75.61%；其次是總抗氧化能力，降幅達(dá)到59.52%。這與趙熙等研究結(jié)果相一致[20]。

2.3 體外抗氧化活性與生化成分的相關(guān)性分析

表4 是普洱生茶的體外抗氧化活性與對應(yīng)生化成分的相關(guān)性分析。

表4 體外抗氧化活性與生化成分的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of antioxidant activity and biochemical components in vitro

從表4 中可以看出，普洱生茶的體外抗氧化活性和生化成分都呈現(xiàn)正相關(guān)。其中抗氧化活性與茶多酚和氨基酸有極顯著相關(guān)性（p＜0.01），與兒茶素總量有顯著相關(guān)性（p＜0.05），其次是咖啡堿和水浸出物。這與馬慧等研究結(jié)果相一致[21]。其原因可能是：隨著儲存時間的增加，普洱生茶在多酚氧化酶的作用下，兒茶素類會發(fā)生氧化反應(yīng)和氧化偶聯(lián)反應(yīng)等生成了鄰苯酚醌及鄰醌類物質(zhì)。在此過程中，多酚羥基的數(shù)量會減少，所以抗氧化能力也就相應(yīng)降低。氨基酸具有一定的抗氧化活性，但是相比于一些酚類、黃酮類、維生素類強(qiáng)抗氧化劑，氨基酸的抗氧化活性相對較小。由于氨基酸和其它抗氧化劑的還原電位不同決定了二者之間發(fā)生修復(fù)再生作用，即協(xié)同抗氧化能力，所以，氨基酸發(fā)揮其抗氧化活性的作用機(jī)理之一便是與其它抗氧化劑發(fā)揮協(xié)同抗氧化的作用[22]。隨著儲存時間的增加，氨基酸會發(fā)生降解，也會與多酚類反應(yīng)生成了不同分子量的聚合物，所以氨基酸含量會降低，導(dǎo)致抗氧化能力也就相應(yīng)降低?？Х葔A化學(xué)性質(zhì)不活潑，是一種嘌呤堿雜環(huán)化合物，難以參與氧化降解反應(yīng)，但咖啡堿和多酚類會因修復(fù)再生的關(guān)系發(fā)揮協(xié)同抗氧化的作用[23]。茶葉水浸出物中含有多酚類（包括水溶性色素）、游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水溶維生素、水溶果膠、水溶蛋白、無機(jī)鹽等，因而茶葉中的水溶性成分抗氧化性有一定的復(fù)雜性[23]。

3 結(jié)論

本試驗將茶葉水提物與VC的抗氧化能力進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普洱生茶水提物有較高的體外抗氧化活性。且體外抗氧化活性和生化成分都呈現(xiàn)正相關(guān)性，其中與茶多酚和氨基酸含量呈極顯著正相關(guān)，表明茶葉中茶多酚具有良好的抗氧化性能，為茶多酚作為抗氧化劑應(yīng)用到食品加工中提供了一定的依據(jù)。