姜奧宇，胡 蓮，陳 東*，唐啟源，郭 楠，沈維軍，萬發(fā)春，任 杰，李付強(qiáng)

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.婁底市新化縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南婁底 417600；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南長沙 410128；4.瀏陽市動(dòng)物疫病防控中心，湖南瀏陽 410300；5.湖南天華實(shí)業(yè)有限公司，湖南婁底 417000）

水稻作為我國重要農(nóng)作物之一，年播種面積約為3 000 萬hm2，稻谷年產(chǎn)量為2 億t 以上[1]，按谷草比1:1[2]計(jì)算，每年產(chǎn)生水稻秸稈約為2 億t，通過測算，我國主要農(nóng)作物秸稈總量呈穩(wěn)步緩慢上升趨勢，其年平均增長率為1.66%。農(nóng)作物秸稈氮、磷、鉀等礦物元素含量豐富，但纖維含量較高，養(yǎng)分利用率較低[3]，通過食用菌栽培方法可以提高秸稈利用附加值，發(fā)酵后菌糠可飼喂動(dòng)物，對發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)、提升農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。平菇在我國人工栽培食用菌中產(chǎn)量第一，具有重要的食藥用價(jià)值[4]。將食用菌栽培副產(chǎn)物菌糠適當(dāng)替代日糧粗飼料，有利于提高干物質(zhì)采食量及營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃降解率[5-6]。目前，利用真菌發(fā)酵改善秸稈及菌糠養(yǎng)分利用率的研究頗受關(guān)注。龔劍明等[7]將P.chrysosporium等4 種真菌接種油菜秸稈進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其常規(guī)養(yǎng)分及幾丁質(zhì)含量顯著提高，且體外發(fā)酵有機(jī)物降解率不同程度提高。利用白腐真菌處理農(nóng)作物秸稈可改變其木質(zhì)素等異質(zhì)高聚大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)，顯著提高秸稈瘤胃干物質(zhì)消失率[8]。劉啟燕等[9]研究發(fā)現(xiàn)，金針菇菌糠的纖維含量優(yōu)于稻草、燕麥草及青貯，用其飼喂奶?？娠@著提升產(chǎn)奶量，在一定程度上發(fā)酵菌糠有利于改善奶牛的健康狀況。作為草食動(dòng)物粗飼料資源，菌糠廣受關(guān)注，目前研究主要集中在單一的真菌發(fā)酵或直接利用副產(chǎn)物進(jìn)行飼喂，對不同收菇茬次菌糠的系統(tǒng)研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以稻草秸稈（以下簡稱“稻秸”）為主要碳源，輔以麩皮和豆粕混合接種平菇菌株，評價(jià)不同收菇次數(shù)稻秸平菇菌糠常規(guī)養(yǎng)分含量及體外發(fā)酵特性，為平菇發(fā)酵稻秸技術(shù)以及高效利用菌糠資源提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 平菇栽培料接種與制作 平菇菌種由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌工程研究中心提供，稻秸為大通湖區(qū)宏碩生態(tài)農(nóng)業(yè)農(nóng)機(jī)合作社試驗(yàn)地種植的水稻（湘兩優(yōu)900）完熟收割后的剩余秸稈。真菌接種過程參考文獻(xiàn)[10]：將稻秸切至1.5～2.5 cm 長短，在1%（質(zhì)量體積比）石灰水中浸泡48 h 后瀝干，按稻秸85%、麩皮10% 和豆粕5%（干物質(zhì)基礎(chǔ)）的比例混合均勻，裝包（1 kg/ 包），栽培料營養(yǎng)成分如表1 所示；滅菌（120～125℃、0.15～0.20 MPa、4 h）后進(jìn)行接種（1 cm×1 cm×1 cm 平菇塊/包），菌種用量為栽培料質(zhì)量的5%，在（25±2）℃下進(jìn)行避光有氧培養(yǎng)。分別在第0、1、2 茬收集菌糠，65℃烘干粉碎后，選用60 目孔篩（250 μm 粒度）進(jìn)行過篩，用于常規(guī)營養(yǎng)成分測定和體外發(fā)酵。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用3 種平菇真菌六月灰（Oyster Mushroom Liuyuehui，OML）、1676（Oyster Mushroom1676，OM1）和江都71（Oyster Mushroom Jiangdu71，OMJ）分別接種于表1 所示稻秸栽培料基質(zhì)，接種當(dāng)天記為第0 天，在菌絲長滿出菇前收集菌糠，記為第0 茬菌糠，當(dāng)平菇菌蓋基本展開，其顏色呈現(xiàn)淡灰色或灰白色時(shí)進(jìn)行收菇，第1 次收菇后收集菌糠，記為第1 茬，第2 次收菇后收集菌糠，記為第2 茬。共計(jì)3×3 個(gè)處理，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)2 個(gè)空白對照樣。各處理組信息見表2。

表2 各菌菇的收菇時(shí)間

1.3 體外模擬瘤胃發(fā)酵設(shè)備 本試驗(yàn)采用全自動(dòng)體外模擬瘤胃發(fā)酵設(shè)備，具體參數(shù)設(shè)定及使用操作參照Wang等[12]研究。發(fā)酵瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中，通過導(dǎo)管與三通電磁閥（3V320-08，寧波奉化永利氣動(dòng)成套有限公司）和壓力傳感器（CYG130-12，昆山雙橋傳感器測控技術(shù)有限公司）連接。壓力傳感器對發(fā)酵瓶中的壓力進(jìn)行測定并記錄，根據(jù)壓力與氣體體積間的關(guān)系計(jì)算72 h 氣體生成量。當(dāng)發(fā)酵瓶中壓力到達(dá)設(shè)定排氣壓力（9 kPa）時(shí)，計(jì)算機(jī)控制電磁閥打開，發(fā)酵瓶中的氣體通過導(dǎo)管進(jìn)入氣相色譜儀（安捷倫 7890A，美國）測定甲烷和氫氣含量，其中甲烷檢測用色譜柱規(guī)格（GB3591-80047）：2.44 m×3.175 mm×2 mm，火焰電離檢測器（FID）檢測溫度為300 ℃，載體為N2（流速為30 mL/min）。氫氣檢測用色譜柱規(guī)格（GB3591-80047）：1.22 m×3.175 mm×2 mm，熱導(dǎo)檢測器（TCD）檢測溫度為200℃。根據(jù)甲烷和氫氣含量、壓力與氣體體積間轉(zhuǎn)化系數(shù)計(jì)算甲烷和氫氣產(chǎn)量[13]。

1.4 人工瘤胃液培養(yǎng)液 瘤胃液供體羊選擇3 只體況良好、體重（25.0±2.0）kg 且安裝有永久性瘤胃瘺管的去勢成年湘東黑山羊。飼糧參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816-2004），配制精粗比為40:60 的基礎(chǔ)飼糧。稻秸用鍘草機(jī)切至2～3 cm 長短，精料經(jīng)2.5 mm 篩粉碎，基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)成分見表3。試驗(yàn)期內(nèi)每頭供體羊每天飼喂基礎(chǔ)日糧500 g，每天于08:30 和18:00 飼喂。

表3 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

人工瘤胃緩沖液：參照Menke 等[14]提供的方法配制2 400 mL 的人工瘤胃緩沖液。向緩沖液中持續(xù)通入CO2氣體，加入2.0 mL 刃天青溶液后置于恒溫磁力攪拌器上預(yù)熱至39.5℃，保持溶液厭氧環(huán)境，直至緩沖液從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榻鼰o色即可。

人工瘤胃培養(yǎng)液：試驗(yàn)當(dāng)天晨飼前1 h，通過瘤胃瘺管采集供體羊瘤胃液裝入保溫瓶，瘤胃液混合均勻后迅速用4 層脫脂紗布過濾于接收瓶，量取600 mL 過濾液迅速加入到準(zhǔn)備好的2 400 mL 人工瘤胃緩沖液中（瘤胃液與緩沖液配比為1:4），期間持續(xù)沖入CO2確保厭氧環(huán)境，制成人工瘤胃培養(yǎng)液。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 體外模擬瘤胃發(fā)酵 稱取0.6 g 底物放入150 mL發(fā)酵瓶中，加入60 mL 人工瘤胃培養(yǎng)液，放置于恒溫培養(yǎng)箱（振蕩頻率50 r/min，溫度39.5℃）中預(yù)熱。取出發(fā)酵瓶，通入CO2保證厭氧環(huán)境。依次向每個(gè)發(fā)酵瓶中加入60 mL 人工瘤胃培養(yǎng)液，并將發(fā)酵瓶放回恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外模擬瘤胃發(fā)酵，72 h 后終止發(fā)酵。

1.5.2 樣品采集 體外模擬瘤胃發(fā)酵，72 h 后終止發(fā)酵，取2 mL 發(fā)酵液，4℃、15 000 r/min 離心10 min。取1 mL上清液于2 mL 離心管中，加入0.1 mL 25% 偏磷酸固定15 min，-20℃保存，用于總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）、氨態(tài)氮（NH3-N）測定。將發(fā)酵內(nèi)容物用紗布抽干置于鋁盒中，105℃烘箱中烘8 h，測定干物質(zhì)降解率（DM Degradability，DMD）。

1.5.3 指標(biāo)測定 干物質(zhì)（DM）、CP、NDF、ADF、EE分別按標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 6435-2014、GB/T 24318-2009、GB/T 20806-2006、NY/T 1459-2007、GB/T 6433-2006）進(jìn)行測定，總能（GE）采用氧彈燃燒法測定，用Spectrum 公司SI400 型pH 計(jì)測定體外發(fā)酵液pH。通過裝有檢測器和HP-INNOwax（30.0 m×320 μm×0.5 μm，Catalog No:19091N-213）毛細(xì)管色譜柱的氣相色譜儀（GC-2010；Shimadzu Corporation，Japan）測定VFA。體外發(fā)酵濾液采用T/CAAA 003-2018 中的苯酚-次氯酸鈉比色法測定NH3-N 含量。

DMD=（放入發(fā)酵瓶前底物重-終止發(fā)酵后殘留底物重）/（放入發(fā)酵瓶前底物重）×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010 整理，使用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件中一般線性模型（GLM）的多因素方差分析計(jì)算兩因素（品種、茬次）的主效應(yīng)及交互效應(yīng)，差異顯著則運(yùn)用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種平菇不同收菇茬次對菌糠營養(yǎng)成分的影響 由表4 可知，OML 組的CP 和TDN 含量顯著高于OM1和OMJ 組，且NDF 和ADF 含量顯著低于其他兩組，OMJ 組EE 和GE 含量較高；CP、NDF、ADF 以及TDN 在不同品種、茬次及兩者交互上均具有極顯著效應(yīng)，且3 組稻秸平菇菌糠NDF 和ADF 含量隨著收菇茬次增加而逐漸降低，說明纖維成分得到有效降解?？傮w來看，OML 菌糠的營養(yǎng)成分更優(yōu)。

2.2 3 種平菇不同收菇茬次對菌糠體外發(fā)酵的影響 由表5 可知，體外瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)中，3 組稻秸平菇菌糠發(fā)酵產(chǎn)物各有差異。72 h 總產(chǎn)氣量、甲烷及氫氣產(chǎn)量均表現(xiàn)為OML-0 組顯著高于其他組，且茬次和交互效應(yīng)為極顯著。在DMD 方面，OM1 和OMJ 組DMD 先減后增，OML 組呈逐漸降低的趨勢，且OML-0 組顯著高于其他組。隨著收菇茬次的增加，OM1 和OMJ 組體外發(fā)酵NH3-N 和TVFA 濃度表現(xiàn)為先增后減的趨勢，而OML-0 組NH3-N 和TVFA 濃度分別達(dá)到9.80 mg/dL 和74.67 mmol/L，為所有試驗(yàn)組產(chǎn)量最高值。

2.3 不同稻秸平菇菌糠體外發(fā)酵VFA 各組分分析 由表6 可知，OMJ 組乙酸和丙酸比例較OM1 和OML 組更為穩(wěn)定，OM1 組丙酸比例顯著高于其他兩組，OML組丁酸、異丁酸、戊酸以及異戊酸比例均保持較高水平。OM1 和OML 組乙丙比隨著收菇茬次增加均保持上升的趨勢，OMJ 組差異不顯著，且乙酸、丙酸、丁酸和乙丙比的品種、茬次以及交互效應(yīng)均達(dá)顯著水平。

3 討 論

3.1 不同稻秸平菇菌糠營養(yǎng)成分 菌糠營養(yǎng)成分與食用菌的種類、收茬時(shí)期及培養(yǎng)基成分等多種因素有關(guān)。本試驗(yàn)中，3 種平菇菌糠隨收茬時(shí)間延長，GE 均出現(xiàn)不同程度減少，這與平菇菌絲體在代謝過程中消耗基質(zhì)能量進(jìn)行纖維素降解有關(guān)[15]；除OML 品種外，OM1 和OMJ 均表現(xiàn)為第1 茬菌糠CP 含量最高，且相較于栽培料CP 含量提升72% 以上，原因可能是平菇菌糠中部分蛋白質(zhì)來源于平菇真菌的轉(zhuǎn)化和生物固氮作用，合成的菌體蛋白質(zhì)部分殘留菌糠中[16]，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，氮素轉(zhuǎn)移至菌絲體[17-18]，這與張純等[19]研究結(jié)果一致。龔劍明等[7]用不同真菌發(fā)酵油菜秸稈，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)分含量及酶活性存在差異，本研究中OML-0 和OML-2組CP 含量均高于同時(shí)期其他2 種平菇菌糠，原因可能是OML 在菌糠中殘留的菌體蛋白較其他2 種平菇更多，其次在平菇栽培過程中，不同時(shí)期蛋白酶的活性差異可能影響了菌糠CP 含量。在本試驗(yàn)中，3 種平菇菌糠隨著收菇茬次的增加，NDF 和ADF 含量顯著下降，在栽培料基礎(chǔ)上降幅分別超過49%和45%，說明平菇真菌發(fā)酵可作為一種有效降低稻秸纖維素的手段，其主要機(jī)制為食用菌代謝過程中，菌絲體細(xì)胞分泌纖維素酶、木質(zhì)素過氧化酶等胞外酶[20]，通過酶解作用把纖維素等大分子物質(zhì)分解成單糖等可溶性碳水化合物[21]，降低NDF 和半纖維素含量。這也導(dǎo)致3 種平菇菌糠TDN 隨收茬次數(shù)增加而顯著增加，說明適當(dāng)延長平菇真菌發(fā)酵時(shí)間有利于提升菌糠相對飼用價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，OML-2 組NDF 和ADF 降解率較栽培料降幅分別達(dá)到68%和71%，效果顯著優(yōu)于OM1 和OMJ，說明不同平菇菌株對纖維素的降解率存在顯著差異，OML 對稻秸的纖維降解能力更強(qiáng)。在干物質(zhì)降解方面，OM1-1 和OMJ-1 組DMD 低于同品種其他時(shí)期，而72 h 總產(chǎn)氣量和TVFA 濃度保持較高水平，這可能與較高的CP 以及適宜的NDF 含量有關(guān)，可保證足夠底物供瘤胃微生物發(fā)酵，從而提高瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物含量；另一方面，不同發(fā)酵底物的NFC/NDF 也會對瘤胃微生物區(qū)系組成產(chǎn)生影響，有研究指出該比例為1.61 時(shí)更適合瘤胃發(fā)酵[22]。因此，從菌糠營養(yǎng)角度出發(fā)，在CP 含量和纖維降解特性方面，OML 品種優(yōu)于OMJ 和OM1。

表4 不同稻秸平菇菌糠營養(yǎng)成分分析（風(fēng)干基礎(chǔ)）

3.2 不同稻秸平菇菌糠體外發(fā)酵特性 pH 是瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)，瘤胃微生物繁殖適宜的pH 范圍為6.0～7.0[23]。NH3-N 作為瘤胃氮代謝過程外源及內(nèi)源含氮物質(zhì)分解的終產(chǎn)物，是合成微生物蛋白及機(jī)體蛋白的主要原料。Owens 等[24]研究指出，瘤胃微生物合成菌體蛋白所需的NH3-N 濃度范圍為0.35～29 mg/dL。本試驗(yàn)各組體外瘤胃發(fā)酵液pH（6.59～6.86）和NH3-N 濃度（5.31～9.80 mg/dL）均位于正常范圍，說明瘤胃發(fā)酵液pH 和NH3-N 濃度適合微生物生長和微生物蛋白合成，OM1-1、OMJ-1 和OML-0 組pH 均顯著低于同品種其他時(shí)期，而NH3-N 濃度和72 h 總產(chǎn)氣量均顯著高于同品種其他時(shí)期，這與營養(yǎng)指標(biāo)中CP 含量的變化趨勢一致，原因可能是OM1-1、OMJ-1 和OML-0 組菌體代謝活動(dòng)旺盛，產(chǎn)生更多的菌體蛋白和可溶性碳水化合物，促進(jìn)瘤胃微生物吸收利用，產(chǎn)生NH3-N 和VFA 等代謝物，從而降低體外發(fā)酵液pH[25]。而OML 品種表現(xiàn)為第0 茬NH3-N 濃度顯著高于第1 茬和第2 茬，這與OML-0 組CP 含量顯著高于OML-1 和OML-2 組的結(jié)果一致。VFA 可被瘤胃上皮組織以被動(dòng)擴(kuò)散形式、VFA和HCO3-陰離子交換以及電介導(dǎo)等轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，為反芻動(dòng)物持續(xù)提供能量[26]，其中乙酸、丙酸和丁酸約占TVFA的95%。瘤胃中VFA 組分差異與發(fā)酵底物碳水化合物組分密切相關(guān)，OM1-1、OMJ-1 和OML-0 組TVFA 濃度均顯著高于同品種其他時(shí)期，且乙酸、丙酸、丁酸具有增加的趨勢。說明稻秸在發(fā)酵過程中，OM1 和OMJ菌糠碳水化合物含量在第1 茬時(shí)達(dá)到最高，瘤胃微生物代謝產(chǎn)生VFA 含量較多。一般而言，飼糧纖維水平降低有利于乙酸/丙酸比例減小，3 種平菇菌糠都表現(xiàn)為第0 茬NDF 和ADF 含量最高，而OM1-0 和OML-0組乙酸/丙酸比例顯著低于同品種其他時(shí)期，OMJ-0 組乙酸/丙酸比例具有顯著降低的趨勢，這與Giger 等[27]的研究結(jié)果存在差異，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

表5 不同稻秸平菇菌糠體外瘤胃發(fā)酵特性分析（風(fēng)干基礎(chǔ)）

碳水化合物在瘤胃發(fā)酵伴隨產(chǎn)生氫，從而轉(zhuǎn)變?yōu)闅錃?，其中溶解態(tài)氫是甲烷菌利用二氧化碳合成甲烷的重要前體物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，OMJ-1 與OML-0 組氫氣、甲烷及72 h 總產(chǎn)氣量顯著高于同品種其他2 茬菌糠，且OM1-1 組氫氣、甲烷及72 h 總產(chǎn)氣量保持在較高水平，說明甲烷菌和其他厭氧真菌對于以上階段菌糠的活性更強(qiáng)，吸收利用率更高，OM1-1、OMJ-1 與OML-0組菌糠中碳水化合物降解較快，從而產(chǎn)生大量氫氣，氫氣的生成速率超過甲烷菌對其消耗速率時(shí)，導(dǎo)致氫氣積累且甲烷產(chǎn)量明顯增加[28]。Huang 等[29]報(bào)道，用平菇真菌處理稻秸25 d 可改變其氣孔率和比表面積等物理性質(zhì)，分別提高稻秸對纖維素酶和木聚糖酶吸附量18.8%和58.1%，可促進(jìn)生物甲烷的生成，處理時(shí)間較符合本試驗(yàn)中OM1-1、OMJ-1、OML-0 組的收茬時(shí)期，且甲烷含量顯著高于同品種其他時(shí)期。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同收菇次數(shù)處理的稻秸平菇菌糠中，OM1 和OMJ 菌糠營養(yǎng)成分含量和體外發(fā)酵特性變化規(guī)律相似，均表現(xiàn)為第1 茬菌糠CP 含量和體外發(fā)酵參數(shù)較優(yōu)，而OML 菌糠表現(xiàn)為第0 茬菌糠CP 含量和瘤胃發(fā)酵特性優(yōu)于后兩茬菌糠。整體而言，3 種菌糠隨著收茬次數(shù)增加，NDF 和ADF 含量不同程度降低。不同品種稻秸平菇菌糠中，OML-0 組營養(yǎng)物質(zhì)組成優(yōu)于同一茬次其他2 種平菇菌糠，VFA 各組分比例更加合理，有利于反芻動(dòng)物瘤胃微生物繁殖，合成微生物蛋白用于機(jī)體組成及生理代謝。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步篩選平菇真菌發(fā)酵稻秸提供數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)降解差異機(jī)理有待進(jìn)一步研究。