糜長(zhǎng)浩，鄒文斌，于海亮，王曉慧，黃施杰，張跟喜，戴國(guó)俊*，張 濤，謝愷舟，施會(huì)強(qiáng)，王金玉

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225000；2.江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇南通 226100）

雞人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用提高了種公雞的利用率，促進(jìn)了家禽業(yè)集約化和規(guī)?；l(fā)展，然而人工授精技術(shù)優(yōu)越性的實(shí)現(xiàn)主要依賴于精液稀釋液的品質(zhì)[1]。精液中添加稀釋液不僅能延長(zhǎng)精液的保存時(shí)間并擴(kuò)大精液劑量，還可以為精子提供良好的生存環(huán)境，維持滲透壓和電解質(zhì)平衡，保護(hù)精子細(xì)胞膜的完整，降低精液的畸形率[2]。新鮮的精液原液經(jīng)過(guò)稀釋液稀釋后，能夠提高種蛋受精率和母雞的受精效率，減少種公雞的飼養(yǎng)成本[3]。因此，開(kāi)展雞精液稀釋液系統(tǒng)研究對(duì)家禽業(yè)繁殖和生產(chǎn)具有重要意義。

海揚(yáng)黃雞是經(jīng)國(guó)家遺傳資源委審定的優(yōu)質(zhì)肉雞新品種（配套系），具有全方面疾病凈化、整齊度高、抗病力強(qiáng)、胸肌率高、腹脂率少的特點(diǎn)[4]。先前關(guān)于雞精液稀釋液的研究較多，不同稀釋液的效果不盡一致[5]。本研究以海揚(yáng)黃雞為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)3 種不同的精液稀釋液（基礎(chǔ)稀釋液、BPSE 稀釋液、自配稀釋液）稀釋后在體外存放不同時(shí)間以及2 種處理的自配稀釋液存放不同天數(shù)稀釋后的精液品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定比較，以期探討適合海揚(yáng)黃雞的精液稀釋液配方，旨在為海揚(yáng)黃雞的人工授精技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器 選取海揚(yáng)黃雞配套系親本FF 系50 只種公雞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。EPED-10DJ 型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)購(gòu)自南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；電子天平購(gòu)自塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；蒸汽滅菌器購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機(jī)購(gòu)自愛(ài)普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司；奧林巴斯CX31 生物顯微鏡購(gòu)自北京佳源興業(yè)科技有限公司；恒溫水浴鍋購(gòu)自上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；集精杯、載玻片、蓋玻片、移液槍、血球計(jì)數(shù)板等。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 實(shí)驗(yàn)用種公雞每2 d 進(jìn)行1次采精訓(xùn)練，采精方式為背腹式按摩法[6]，于適應(yīng)性訓(xùn)練后的第8 天早上喂料前，采集50 只空腹公雞的精液，其中30 只公雞隨機(jī)分成5 組，每組6 只，將每組公雞的精液均勻混合后等量分為3 份，分別用3 種稀釋液（配方見(jiàn)表1，自配稀釋液數(shù)據(jù)沒(méi)有公開(kāi)），按1:2 比例進(jìn)行稀釋，采用單因子完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行試驗(yàn)，區(qū)組為5 個(gè)不同的組，比較3 種稀釋液稀釋后0.5和1.5 h 的精液品質(zhì)，從而選出最優(yōu)稀釋液。不同滅菌方式和不同稀釋液存放時(shí)間的分析采用2×2 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)，滅菌方式的2 個(gè)水平分別為100℃和雙抗（青霉素和鏈霉素），稀釋液存放時(shí)間的2 個(gè)水平分別為3 d 和6 d，4℃冰箱存放，將其余20 只公雞精液隨機(jī)分為4 組，用最優(yōu)稀釋液按1:2 稀釋后，隨機(jī)安排到4 個(gè)水平組合處理數(shù)中，每個(gè)處理重復(fù)數(shù)為5。

表1 精液稀釋液的配方

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 精子活力 用滴管吸取稀釋后的精液，滴在載玻片，用顯微鏡觀察并計(jì)算顯微鏡一個(gè)視野中直線運(yùn)動(dòng)的精子個(gè)數(shù)。精子活力=直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/視野中精子數(shù)×100%。

1.3.2 精子活率 采用伊紅-苯胺黑活體染色技術(shù)染色法測(cè)定精子活率，即將5% 伊紅1% 苯胺黑染液以1:4體積混勻，3 μL 精液加入100 μL 混合染液的EP 管混勻，取10 μL 染色液-精液混合液涂片，均勻地涂抹在載玻片上，自然風(fēng)干后，400 倍光學(xué)顯微鏡視野下計(jì)數(shù)300個(gè)精子，統(tǒng)計(jì)所含的活精子數(shù)所占比例[7]。

1.3.3 精子畸形率 取20 μL 精液加入180 μL 0.9% 的氯化鈉稀釋混勻，取20 μL 精液混合液制備精液涂片，用姬姆薩染色法染色，每張抹片觀察50 個(gè)精子，計(jì)數(shù)其中的畸形精子[8]，精子畸形的判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[9]。精子畸形率=所數(shù)精子中畸形精子總數(shù)/500×100%。

1.3.4 精液死精率 使用移液槍吸取15 μL 稀釋液到載玻片上，用蓋玻片蓋住制成抹片，然后放置于顯微鏡400 倍視野下進(jìn)行觀察。分別觀察5 個(gè)視野中的精子情況，數(shù)出視野中不動(dòng)的精子，并數(shù)出每個(gè)視野中的精子總數(shù)，每個(gè)視野中精子數(shù)不少于200 個(gè)。精液死精率=所數(shù)精子中不動(dòng)的精子數(shù)/所數(shù)的總精子數(shù)×100%。

1.3.5 精子密度 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，方法參考文獻(xiàn)[10]。有效精子數(shù)=精液量×精子密度×精子活率。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 整理，不同稀釋液間測(cè)定指標(biāo)的差異顯著性比較采用兩因子方差分析，統(tǒng)計(jì)分析模型為：y=μ+α+β+e，其中μ為總體均數(shù)，α為不同稀釋液的效應(yīng)，β為區(qū)組效應(yīng)，e為誤差效應(yīng)；不同滅菌方式和不同稀釋液存放天數(shù)對(duì)所測(cè)精液品質(zhì)指標(biāo)也采用兩因子方差分析，統(tǒng)計(jì)分析模型同前，α為不同滅菌方式的效應(yīng)，β為稀釋液不同存放時(shí)間的效應(yīng)。多重比較均采用LSD 法。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件上運(yùn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精液稀釋液稀釋后體外存放時(shí)間不同對(duì)精液品質(zhì)影響 由表2 可見(jiàn)，存放0.5 h 后，自配稀釋液稀釋后的精子活力較BPSE 稀釋液提高了2.29%（P＜0.05），與基礎(chǔ)稀釋液無(wú)顯著差異；自配稀釋液稀釋后的精子活率最高，較基礎(chǔ)稀釋液、BPSE 稀釋液分別提高0.65%（P＜0.05）、0.66%（P＜0.05），基礎(chǔ)稀釋液和BPSE稀釋液稀釋的精液活率無(wú)顯著差異；基礎(chǔ)稀釋液畸形率最低，BPSE 稀釋液稀釋的精子畸形率最高，分別比基礎(chǔ)稀釋液、自配稀釋液提高7.5%（P＜0.05）、3.14%（P＜0.05）。存放1.5 h 后自配稀釋液稀釋后的精子活力和精子活率均為最高，精子活力與BPSE 稀釋液無(wú)顯著差異，較基礎(chǔ)稀釋液提高4.61%（P＜0.05），精子活率較基礎(chǔ)稀釋液和BPSE 稀釋液分別提高0.98%（P＜0.05）、1.12%（P＜0.05）；自配稀釋液稀釋的精子畸形率最低，BPSE 稀釋液稀釋的精子畸形率最高，較基礎(chǔ)稀釋液、自配稀釋液分別提高7.96%（P＜0.05）、10.42%（P＜0.05）；3 種稀釋液稀釋的精液在體外存放0.5 h 和1.5 h 之后，精液死精率均無(wú)顯著差異，但在1.5 h時(shí)自配稀釋液死精率最低。

2.2 2 種處理的自配稀釋液存放不同天數(shù)稀釋后精液品質(zhì)分析 由表3 可見(jiàn)，經(jīng)2 種不同處理的自配精液稀釋液稀釋并存放3 d 和6 d 之后精液品質(zhì)的各相關(guān)指標(biāo)均無(wú)顯著差異。

3 討 論

3.1 不同精液稀釋液稀釋后在體外存放不同時(shí)間對(duì)精液品質(zhì)的影響 精液品質(zhì)直接關(guān)系到受精率的高低[11]，而良好的精液品質(zhì)又與稀釋液物質(zhì)組成有著密切的關(guān)系[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，雞精液稀釋后精子的運(yùn)動(dòng)度、ATP 交換、氣體交換和離子平衡等都會(huì)受到稀釋液成分的影響，特別是稀釋比例較高時(shí)[13]。李潔等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在精液稀釋液中添加適宜濃度的N-乙酰半胱氨酸可以顯著提高精子生存指數(shù)以及延長(zhǎng)精子的生存時(shí)間。趙萬(wàn)樂(lè)等[15]研究表明，在精液稀釋液當(dāng)中添加適量的L-半胱氨酸可以明顯延長(zhǎng)精子壽命。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自配稀釋液稀釋的精子活率和精子活力顯著高于BPSE 稀釋液和基礎(chǔ)稀釋液，3 種稀釋液的精子死精率沒(méi)有顯著差異，但在1.5 h 時(shí)自配稀釋液的死精率最低，BPSE 稀釋液稀釋后的精子畸形率在存放0.5 h 和1.5 h 后均為最高。因此自配稀釋液稀釋后的精液品質(zhì)要優(yōu)于其他2 種稀釋液。這可能是因?yàn)樽耘湎♂屢褐屑尤肓诉m量的果糖和谷氨酸鈉，谷氨酸鈉具有延長(zhǎng)精子壽命的作用[16]。稀釋液中的糖類可以有效保護(hù)精子質(zhì)膜的完整性[17]，對(duì)穩(wěn)定精子的形態(tài)完整具有良好作用，且果糖的效果要好于葡萄糖[18]。此外，自配稀釋液中還有磷酸二氫鉀和磷酸二鉀氫2 種緩沖物質(zhì)，它們能夠保證精液具有適宜的pH，以利于精子存活[19]。

3.2 2 種處理的自配稀釋液存放不同天數(shù)對(duì)精液品質(zhì)的影響 陶劍等[20]研究發(fā)現(xiàn)，精液采用3 種不同稀釋液稀釋后在室溫保存3 d 仍能滿足人工授精的精子活力的要求。周小楓等[21]研究發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)存2 個(gè)月的精液稀釋液的孵化率與現(xiàn)配現(xiàn)用的精液稀釋液沒(méi)有顯著差異。本試驗(yàn)中，經(jīng)煮沸滅菌和加入雙抗的自配精液稀釋液存放3 d 和6 d 之后精液品質(zhì)的各相關(guān)指標(biāo)均無(wú)顯著差異。

4 結(jié) 論

自配稀釋液稀釋后精液品質(zhì)優(yōu)于BPSE 稀釋液和基礎(chǔ)稀釋液，有充足的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)精子的物質(zhì)，同時(shí)具有一定的緩沖能力，可以考慮作為海揚(yáng)黃雞的精液稀釋液；經(jīng)過(guò)煮沸滅菌或加入雙抗處理的自配精液稀釋液保存6 d之內(nèi)對(duì)所測(cè)精液品質(zhì)指標(biāo)沒(méi)有影響。