李娜，劉銘，劉嵐錚，白愛英，關(guān)恒云，劉輝

（濟南市疾病預(yù)防控制中心，山東 濟南 250000）

0 引言

瘧疾是瘧原蟲通過按蚊傳播的嚴(yán)重威脅人類健康的寄生性傳染病[1]，全球最為流行的是惡性瘧和間日瘧，近年來，由于耐藥蟲株和耐殺蟲劑蚊的出現(xiàn)，瘧疾發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，全球防瘧形勢面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。安全有效的瘧疾疫苗仍是現(xiàn)階段控制乃至根除瘧疾的重要手段，因此世界各國高度關(guān)注和支持瘧疾疫苗的研制和開發(fā)[3]。由于間日瘧配子體在患者出現(xiàn)臨床癥狀前已經(jīng)出現(xiàn)在外周血液中，這就使得間日瘧的傳播更難以控制[4]，因此對于防控間日瘧來說，有效的傳播阻斷疫苗的研制開發(fā)顯得尤為重要。Pvs48 是間日瘧原蟲傳播阻斷疫苗的新型候選抗原，它更早的出現(xiàn)在感染宿主體內(nèi)[2]，對其研究具有重大意義。

表位疫苗是現(xiàn)階段疫苗研究的焦點[5-7]，通過基因工程手段，體外表達(dá)并人工合成病原體相關(guān)抗原表位（包括T 細(xì)胞表位和B 細(xì)胞表位），并作為一種疫苗使用即表位疫苗，它可以得到更加高效的提呈，并且能克服傳統(tǒng)疫苗毒力回復(fù)與擴散的缺點，然而，研制表位疫苗的基礎(chǔ)是尋找變應(yīng)原的T 細(xì)胞表位和B 細(xì)胞表位，傳統(tǒng)的確定T.B 細(xì)胞表位的方法是重疊肽法，而這種方法耗時、耗力，若我們先利用生物信息學(xué)技術(shù)對其與MHC 分子結(jié)合的可能性進行預(yù)測從而篩選出最有可能的一些肽段，這樣不僅能大幅度提高工作效率，而且可以有效節(jié)約研究成本[5-7]。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中查詢Pvs48 的基因編碼序列（GenBank 登錄號為JX667762.1）。

1.2 方法

1.2.1 T 細(xì)胞表位預(yù)測軟件

SYFPEITHTI

（http∶//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）

1.2.2 B 細(xì)胞表位預(yù)測軟件

表位數(shù)據(jù)庫IEDB

網(wǎng)址http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input

2 結(jié)果

2.1 Pvs48 的 T 細(xì)胞抗原表位

通過SYFPEITHTI 在線預(yù)測程序的HLA-A*02∶01分析，Pvs48 共含有7 個細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)表位（臨界值為21）見表1；通過SYFPEITHTI 在線預(yù)測程序的HLA-DRB1*0401 分析，Pvs48 含有7 個輔助性T 細(xì)胞（Th）表位（臨界值為21），見表2。

表1 Pvs48 潛在的的CTL 表位

表2 Pvs48 潛在的的Th 表位

2.2 Pvs48 的B 細(xì)胞抗原表位

圖1 f Pvs48 蛋白的B 細(xì)胞線性表位的預(yù)測示意圖

分別采用 Kolaskar &Tongaonkar 方法（圖1A）（默認(rèn)閾值=1.000）、Emini 方法（圖1B）（默認(rèn)閾值=1.000）、Karplus &Schulz 方法（圖1C）（默認(rèn)閾值=1.000）、Parker 方法（圖1D）（默認(rèn)閾值=1.788）和Chou &Fasman 方法（圖1E）（默認(rèn)閾值=1.028）預(yù)測Pvs48 的抗原性、表面易接近程度、柔韌性、親水性及β 轉(zhuǎn)角，圖中顯示高于閾值的肽段部分可能參與了Pvs48 變應(yīng)原線性B 細(xì)胞表位的功能。綜合上述預(yù)測結(jié)果，最終確定了6 個Pvs48的B 細(xì)胞表位（圖1F），見表3。

表3 Pvs48 的B 細(xì)胞抗原表位

3 討論

T 細(xì)胞表位是指抗原通過抗原提呈細(xì)胞加工再由MHC 分子提呈給T 細(xì)胞表面受體的短肽[8]。隨著對MHC 分子構(gòu)象和抗原提呈的逐步了解，T 細(xì)胞表位的預(yù)測也越來越精確。其中，細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）表位是指能與MHC Ⅰ類分子結(jié)合的內(nèi)源性抗原T 細(xì)胞表位；輔助性T 細(xì)胞（Th）表位是指能與MHC Ⅱ類分子結(jié)合的外源性抗原T 細(xì)胞表位。大量研究資料證實，以計算機為基礎(chǔ)的表位預(yù)測方法已經(jīng)成功預(yù)測到了一些病原體的抗原表位。SYFPEITHI是較早的基于已知的能和MHC 類分子（包括 MHC Ⅰ類分子和MHC Ⅱ類分子）結(jié)合槽結(jié)合的T 細(xì)胞表位肽段所建立的網(wǎng)絡(luò)平臺，具有一定的精確性和實用性，是發(fā)展起來的用的比較多的預(yù)測軟件[9,10]，通過SYFPEITHI 對Pvs48 進行表位預(yù)測，成功預(yù)測了Pvs48 中的7 個細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)表位及7個輔助性T 細(xì)胞（Th）表位。

B 細(xì)胞表位是指可被B 細(xì)胞表面受體或抗體特異性識別并相互結(jié)合的片段[11]。IEDB 數(shù)據(jù)庫是于2004 年建立起來的使用最為廣泛并最有權(quán)威性的表位數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫中儲存了大量的通過實驗室確定的B 細(xì)胞抗原表位并且通過生物學(xué)方法開發(fā)了一些B 細(xì)胞表位預(yù)測工具，B 細(xì)胞表位的預(yù)測需要綜合考慮變應(yīng)原的抗原性、表面易接近性、親水性、柔韌性及蛋白質(zhì)的β 轉(zhuǎn)角[12]。變應(yīng)原的抗原性與分子量大小及其化學(xué)組成有關(guān)，抗原的分子量越大、化學(xué)組成越復(fù)雜其抗原性就會越強[13]。表面易接近性是指抗原中的B 細(xì)胞表位與B 細(xì)胞受體（BCR）識別并接近的難易程度，表面易接近性越大，表示抗原中的B 細(xì)胞表位越容易與B 細(xì)胞受體（BCR）接近并識別；抗原的柔韌性高低代表其與BCR 結(jié)合的難易程度，即抗原柔韌性越高，則其與BCR 越容易結(jié)合，反之則越不容易與BCR 結(jié)合；抗原B 細(xì)胞表位的多少則是由抗原親水性的大小決定的；另外，β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的多寡決定了其與BCR 的結(jié)合程度高低；綜合Pvs48 這五個方面的特征成功預(yù)測了6 條Pvs48 的B 細(xì)胞抗原表位肽。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測分析了Pvs48的T、B 細(xì)胞表位，為研究Pvs48 蛋白免疫學(xué)機理及研制多肽疫苗和基因疫苗奠定了一定的理論基礎(chǔ)，對于瘧疾的預(yù)防和治療具有重要意義。