張 杰，程 偉，關玉權，丁鵬飛，潘天全，李 娜，吳 龍

（1.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽阜陽 236023；2.安徽金種子集團有限公司檢測中心，安徽阜陽 236018）

白酒作為中華民族獨具特色的酒精飲料，已經(jīng)歷經(jīng)了幾千年的發(fā)展，成為中華民族傳統(tǒng)文化的重要載體，當前中國白酒處于前所未有的深度轉型期，健康白酒文化的構建與傳播是關鍵之一[1]。白酒作為世界六大蒸餾酒之一，其風味物質和含量極其豐富，而曲料在白酒釀造生產(chǎn)中起著基礎性作用，為優(yōu)質白酒的生產(chǎn)起到關鍵性作用[2]。傳統(tǒng)濃香型白酒釀造以中溫大曲為糖化發(fā)酵劑，隨著白酒技術發(fā)展以及消費者對白酒需求轉變，白酒正向著多香型、復合香型、健康型發(fā)展[3]。對白酒糖化發(fā)酵劑進行創(chuàng)新，研制出由多酶系、多菌種組合的曲料是白酒向復合香型、健康型發(fā)展的方向?，F(xiàn)階段，多數(shù)酒企采用將霉菌、酵母應用到麩曲中，用大曲與麩曲混合、小曲與麩曲混合的方法來提高白酒品質[4]。本研究以企業(yè)自主選育黑曲霉為菌株培養(yǎng)霉菌麩曲，優(yōu)化霉菌麩曲制作中原料配比和培養(yǎng)條件工藝，并初步應用于白酒釀造生產(chǎn)中，以期改善原酒品質，提高出酒率等。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗菌種：企業(yè)從中溫大曲中篩選的高產(chǎn)糖化酶霉菌Mxzd-001，經(jīng)鑒定為黑曲霉，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No19607。

原輔料：土豆、麩皮、稻殼、玉米、豆粕、高粱等，均為市售；乙醇、二氯甲烷等，均為分析純；菌株保藏培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基；霉菌液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL。

儀器設備：霉菌培養(yǎng)箱、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、潔凈工作臺、恒溫振蕩器床、氣相色譜儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備

將保藏的霉菌Mxzd-001 接種到PDA 培養(yǎng)基進行活化，待菌絲長滿平板后，挑取1 環(huán)菌株接種到霉菌液體培養(yǎng)基（在150 mL三角瓶中裝入50 mL液體擴培培養(yǎng)基）中，霉菌液體培養(yǎng)基于35 ℃、130 r/min 搖床培養(yǎng)84 h，待三角瓶中菌絲球生長致密，作為麩曲接種培養(yǎng)的種子液備用。

1.2.2 麩曲原料的配比選擇

實驗霉菌麩曲原料主要采用麩皮、稻殼等，在2000 mL 三角瓶中以稻殼添加量梯度變化培養(yǎng)，確定麩皮與稻殼的最佳配比量。分別稱取原料總質量2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %的稻殼，添加50%的純凈水，121 ℃、0.02 MPa 高壓滅菌30 min，再冷卻至室溫，接種10%種子液，混勻后35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)84 h。

1.2.3 麩曲培養(yǎng)條件的優(yōu)化

培養(yǎng)時間確定：以麩皮∶稻殼=9∶1 的質量比例稱取麩曲制備原料，并添加50%的純凈水，121 ℃、0.02 MPa 高壓滅菌30 min，再冷卻至室溫，接種10%的種子液，混勻后置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔一定時間取樣測定曲料糖化力。

水分含量確定：以麩皮∶稻殼=9∶1 的質量比例稱取麩曲制備原料，分別添加35 %、40 %、45 %、50 %、55 %、60 %的純凈水，121 ℃、0.02 MPa 高壓滅菌30 min，再冷卻至室溫，接種10 %的種子液，混勻后置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)84 h。

培養(yǎng)溫度確定：以麩皮∶稻殼=9∶1的比例稱取麩曲制備原料，添加50%的純凈水，121 ℃、0.02 MPa高壓滅菌30 min，再冷卻至室溫，接種10%的種子液，混勻后分別置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)84 h。

接種量確定：以麩皮∶稻殼=9∶1 的比例稱取麩曲制備原料，添加50%的純凈水，121 ℃、0.02 MPa高壓滅菌30 min，再冷卻至室溫，分別接種2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %的種子液，混勻后置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)84 h。

1.2.4 正交試驗設計

根據(jù)單因素實驗所確定的適宜培養(yǎng)條件，固定原料配比后設計4 因素3 水平正交優(yōu)化實驗，以麩曲糖化酶活力（以下簡稱：糖化力）為指標，進行正交數(shù)據(jù)分析，確定霉菌麩曲的最佳培養(yǎng)條件。

1.2.5 麩曲的釀酒生產(chǎn)應用

傳統(tǒng)濃香型白酒釀造過程中添加中溫大曲作為糖化發(fā)酵劑，其添加量一般為原糧總質量的25 %左右，原料蒸煮、攤晾、拌曲后直接入池發(fā)酵60 d 左右，經(jīng)出池、配醅、蒸餾等工序制得濃香型白酒。本文所述的麩曲試驗白酒是在傳統(tǒng)濃香型白酒釀造工藝的基礎上有所改進，按釀酒原糧總質量10 %的比例添加霉菌麩曲替代10 %的中溫大曲，攤晾后的糧醅加入霉菌麩曲并置于釀酒場地，堆積發(fā)酵2 d；堆積發(fā)酵后的糧醅再攤晾并均勻加入15 %的中溫大曲，入池發(fā)酵60 d，經(jīng)出池、配醅、蒸餾等工序后制得麩曲試驗白酒，檢測三排次試驗酒的出酒率及酒糟殘余淀粉含量并與傳統(tǒng)濃香型白酒對比。

1.3 檢測方法

1.3.1 麩曲糖化力的檢測

霉菌麩曲糖化力測定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中的方法并略有調整[5]。糖化酶活力：在35 ℃、pH4.6 條件下，1 g 大曲1 h 轉化可溶性淀粉生產(chǎn)葡萄糖的毫克數(shù)為一個單位，符號為U，以mg/g·h表示。

1.3.2 產(chǎn)酒分析

氣相色譜條件：LZP-930 型白酒毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×1.0 μm）；柱溫：初始溫度50 ℃，保持3 min，以3 ℃/min 速率升至160 ℃，以10 ℃/min速率升至230 ℃，保留5 min；進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度240 ℃，載氣（N2）流速0.8 mL/min，氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min，尾吹：30 mL/min，分流比：50∶1。產(chǎn)酒率=（產(chǎn)酒總質量÷原料質量）×100%。

1.3.3 酒樣的感官品評

取試驗酒與濃香酒進行感官品評，從色澤（5分）、香氣（20 分）、味（60 分）、風格（5 分）、酒體（5分）、個性（5 分）6 個方面，由10 名以上品酒師組成品評團隊，隨機抽取進行品評。

2 結果與分析

2.1 霉菌麩曲培養(yǎng)的單因素實驗

葉光斌等[6]對根霉3.866 在川法麩曲中的應用研究中得到原料的配比為：糠殼6%，水分65%，培養(yǎng)溫度32 ℃，培養(yǎng)時間84 h。潘婉舒等[7]在醋酸菌麩曲制備工藝研究中以醋酸菌菌落總數(shù)為指標，單因素結合響應面試驗的方法確定其最佳條件乙酸添加量1.03 mL/100 g、乙醇添加量2.09 mL/100 g、接種量4.09 mL/100 g。黃建光等[8]對香醅配料進行優(yōu)化，結果表明，麩皮和鮮酒糟對酵母產(chǎn)酯能力影響較大，而玉米粉的影響不是太大。本文為研究高產(chǎn)糖化酶霉菌Mxzd-001菌種在釀酒麩曲制備中的應用，以糖化力為指標，優(yōu)化該霉菌麩曲的配料比及其培養(yǎng)條件。

2.1.1 稻殼配比的確定

確定培養(yǎng)溫度、水分含量、接種量、培養(yǎng)時間等，分別檢測添加2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %的稻殼所培養(yǎng)霉菌麩曲的糖化力并進行對比。由圖1 可知，麩曲糖化力隨稻殼添加量的增加逐漸提高，當?shù)練ぬ砑恿繛?0%時，麩曲糖化力達到最大值，而后又有所降低。霉菌生長需要適量的空氣，稻殼的添加可增加曲料的疏松程度，有利于空氣流通從而促進霉菌的生長代謝；隨著稻殼添加比例的增加，原料過于疏松而不利于曲料成型或難以為霉菌的生長繁殖提高必要充足的營養(yǎng)成分；因此，確定霉菌麩曲制備原料中稻殼的添加含量為10%。

圖1 稻殼添加量對麩曲糖化力的影響

2.1.2 培養(yǎng)條件的單因素實驗

2.1.2.1 培養(yǎng)時間及水分含量的確定

在確定麩曲制備原料及配比的條件下，設定培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量10 %、曲料水分含量50 %等，分別檢測曲料接種后培養(yǎng)24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h 時的麩曲糖化力，結果如圖2（a）所示。在確定麩曲制備原料及配比的條件下，設定培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量10%、培養(yǎng)時間84 h 等，并設置曲料含水量在35 %、40 %、45 %、50 %、55 %、60 %等，分別檢測所培養(yǎng)霉菌麩曲的糖化力，結果如圖2（b）所示。

培養(yǎng)時間的長短對微生物的生長速度和代謝能力有著重要的影響，前期酶活力呈上升趨勢，之后隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質的消耗以及水分的減少，使得酶活力下降[9]。由圖2（a）可知，隨著培養(yǎng)時間的延長麩曲糖化力先升高再降低，當培養(yǎng)時間為84 h 時，麩曲糖化力達到最大值。麩曲培養(yǎng)前期霉菌主要以繁殖為主而所產(chǎn)糖化酶較少，麩曲培養(yǎng)中期霉菌數(shù)量達到峰值并開始產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，麩曲培養(yǎng)后期，霉菌數(shù)量減少，可能是營養(yǎng)物質消耗使酶代謝受阻。由圖2（b）可知，當曲料水分含量在35 %時，麩曲的糖化力為120 U，顯著低于其他水分含量下的麩曲糖化力。水分含量較低時，曲料過于疏松不易成型，且不利于霉菌生長繁殖；隨著水分含量的增加，麩曲糖化力顯著提高，當水分含量在50%時，麩曲的糖化力達到最大值；當水分含量繼續(xù)增加時，麩曲的糖化力有所下降，水分含量過大使得曲料結合過于緊密，產(chǎn)生過多的熱量而不利于曲料的溫度控制，從而影響糖化酶活力，這與韓英等[10]對清香型白酒中產(chǎn)酶性能的霉菌的研究結果相一致；因此，確定霉菌麩曲培養(yǎng)過程中的曲料水分含量控制在50 %時，更有利于霉菌生長代謝。

2.1.2.2 培養(yǎng)溫度及接種量的確定

在確定麩曲制備原料及配比的條件下，設定曲料水分含量50 %、接種量10 %、培養(yǎng)時間84 h 等，分別檢測置于25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃條件下所培養(yǎng)霉菌麩曲的糖化力，結果如圖3（a）所示。在確定麩曲制備原料及配比的條件下，設定曲料水分含量50%、培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時間84 h 等，設置曲料種子液的接種量分別為2%、4%、6%、8%、10 %、12 %等，分別檢測所培養(yǎng)霉菌麩曲的糖化力，結果如圖3（b）所示。

圖2 培養(yǎng)時間、水分含量對麩曲糖化力的影響

圖3 培養(yǎng)溫度、接種量對麩曲糖化力的影響

溫度是曲料培養(yǎng)的重要指標，尤其微生物生長代謝需要最適的溫度，溫度過低時，微生物活性較低，從而抑制酶類物質代謝，溫度過高時不宜微生物生長，微生物數(shù)量開始減少[11]。由圖4（a）可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，麩曲的糖化力先上升后下降，溫度的變化對霉菌糖化酶代謝有較大的影響；因此，確定麩曲培養(yǎng)溫度控制在35 ℃更有利于提升霉菌麩曲的糖化力。由圖4（b）可知，隨著曲料接種量的增加，麩曲的糖化力呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，在接種量為8 %時，麩曲的糖化力最高為900 U。糖化力下降可能是隨著接種量增加，進入麩曲培養(yǎng)基的初始霉菌數(shù)量增加，培養(yǎng)基的消耗速度加快，這些處于對數(shù)期的種子更快地結束了調整期，通過對數(shù)期進入穩(wěn)定期并接著較快進入衰亡期，從而出現(xiàn)霉菌麩曲糖化力較低的現(xiàn)象[12]。因此，確定麩曲培養(yǎng)接種量控制在8%較為合適。

2.2 霉菌麩曲培養(yǎng)條件的正交實驗

在確定曲料中糠殼的添加量為10 %的條件下，根據(jù)單因素試驗結果，采用L9(34)正交表對培養(yǎng)時間、水分含量、培養(yǎng)溫度和接種量等進行優(yōu)化，以麩曲糖化力為指標，進行正交數(shù)據(jù)分析，確定霉菌麩曲最佳培養(yǎng)條件，其分析結果如表1所示。

表1 霉菌麩曲培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化

由表1 可知，培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、水分含量及接種量對麩曲糖化力均有不同程度的影響，R 值越大，說明該因素對麩曲影響越明顯；其中，RB＞RA＞RC＞RD 表明各因素對麩曲糖化力的影響依次為溫度＞時間＞水分＞接種量。對于因素A（時間）K2＞K3＞K1，所以K2 為因素A 的優(yōu)水平。對于因素B（溫度）K2＞K3＞K1,所以K2 為因素B 的優(yōu)因素。對于因素C（水分含量）K3＞K2＞K1，所以K3 為因素C 的優(yōu)因素。對于因素D（接種量）K3＞K2＞K1，所以K3為因素D的優(yōu)因素，因此，確定最佳條件組合為A2B2C3D3：即該霉菌麩曲的培養(yǎng)溫度35 ℃，培養(yǎng)時間84 h，曲料水分含量55 %，接種量10%等。

2.3 驗證實驗(表2)

表2 霉菌麩曲優(yōu)化條件的驗證實驗結果

對正交試驗結果進行驗證試驗，由表2 可知，優(yōu)化條件培養(yǎng)的霉菌麩曲糖化力達1032 U，相比較正交試驗中較好實驗組增加14.7%，相較于其他霉菌麩曲的糖化力較高，有利于提高釀酒原料的淀粉利用率，并進一步提高原酒出酒率。

如圖4 所示，正交試驗組霉菌麩曲培養(yǎng)過程中的感官變化，麩皮配比10 %稻殼混合均勻蒸煮滅菌，再攤晾降溫到35 ℃左右，種子液的接種量為10 %，曲料含水量在55 %左右；保持培養(yǎng)溫度35 ℃，濕度100 %，間歇通風培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)前期（如圖4a 所示）菌絲開始萌發(fā)，呈乳白色且菌絲較短；再培養(yǎng)48 h，菌絲生長旺盛、菌絲飽滿并深入到曲料內(nèi)部；培養(yǎng)過程中，每天觀察曲料的品溫及干濕情況，及時噴灑無菌水或翻拌曲料，翻拌曲料時可以聞到有明顯曲香。培養(yǎng)中期（如圖4b 所示）菌絲逐漸變長，麩皮開始呈現(xiàn)淺土黃色。待麩曲培養(yǎng)成熟后，通常干燥溫度不高于40 ℃，以保證酶的活力不受影響。粉碎后的成品麩曲呈現(xiàn)土黃或金黃色，具有明顯曲香，無腐臭等異雜味（如圖4c 所示）。

2.4 霉菌麩曲的釀酒應用

圖4 正交實驗霉菌麩曲培養(yǎng)特征

傳統(tǒng)濃香型白酒的釀造生產(chǎn)以中溫大曲為糖化發(fā)酵劑，其主要目的是為發(fā)酵提供正常的糖化力及酯化力，保證產(chǎn)酒量及品質。由于地域差異特點，不同白酒、制曲企業(yè)所生產(chǎn)中溫大曲理化指標各不相同，各企業(yè)應根據(jù)自身生產(chǎn)基礎上對制曲、釀造工藝進行改進，以期達到提升白酒產(chǎn)量、質量的目的，本公司所生產(chǎn)中溫大曲糖化力平均在600～800 U之間。

霉菌麩曲具有高糖化力的特點，取代部分中溫大曲進行堆積發(fā)酵，并配合一部分中溫大曲入池發(fā)酵，其主要目的在于在保證濃香型白酒典型風格的基礎上，提升濃香型白酒的出酒率。傳統(tǒng)濃香型白酒的釀造生產(chǎn)一般添加原糧總質量25%左右的中溫大曲，本文所述的麩曲試驗白酒添加原糧總質量10 %的霉菌麩曲、15 %的中溫大曲。釀酒固態(tài)發(fā)酵結束后對分別采用傳統(tǒng)工藝、霉菌麩曲等釀造生產(chǎn)的原酒進行分段摘酒、按級貯存等，分別取混合樣送檢測部門色譜分析，結果如表3所示。

表3 兩種原酒的色譜分析(g/L)

己酸乙酯是傳統(tǒng)濃香型白酒所具有的代表性香味成分，其含量的高低決定其風格的典型性[13]，乙酸乙酯賦予試驗酒樣清香型白酒的特點，適當?shù)募核嵋阴ヅc乙酸乙酯比例有助于烘托酒體的風味，對白酒放香起到促進作用，對白酒的適口感、豐富度具有重要作用。兩種工藝所釀造生產(chǎn)的原酒中各成分含量相差較小，對白酒風格尤其對濃香型白酒的典型性影響甚小。

表4 霉菌麩曲應用與傳統(tǒng)濃香型白酒產(chǎn)酒對比分析

表4 為霉菌麩曲應用與傳統(tǒng)濃香型白酒產(chǎn)酒對比情況，試驗三排次后對白酒出酒率及殘余淀粉進行分析，結果表明，在使用霉菌麩曲替代部分中溫大曲后第一排次出酒率明顯上升且平均高于傳統(tǒng)工藝釀造的濃香白酒5.9 %左右，表明高糖化力麩曲更大程度上分解原料中淀粉。后續(xù)第二排次和第三排次出酒率與一排次相比稍微有所下降，這是由于白酒釀造采用續(xù)米查蒸料的工藝，一排次使用續(xù)米查殘余淀粉高，高糖化力麩曲充分利用酒糟中的殘余淀粉，使得一排次出酒率高，但之后出酒的多少基本取決于新鮮原料中淀粉含量，酒糟中的殘余淀粉影響較小，故后續(xù)排次出酒率保持穩(wěn)定。霉菌麩曲的使用提升本公司傳統(tǒng)濃香型白酒出酒率，為白酒釀造生產(chǎn)企業(yè)提升原料利用率，更大程度減少資源浪費提供了理論依據(jù)。

2.5 產(chǎn)酒感官品評

白酒的品評主要包括：色澤（5 分）、香氣（20分）、味（60 分）、風格（5 分）、酒體（5 分）、個性（5分）6 個方面。隨機抽取試驗酒和傳統(tǒng)濃香酒樣的混合樣，由10 名以上品酒師組成品評團隊進行品評，平均結果如表5 所示。試驗酒與傳統(tǒng)濃香酒相比雖然評分稍微偏低，但同樣具有濃香型白酒“無色透明、窖香濃郁、綿甜醇厚、香味協(xié)調、尾凈爽口”等風格特點。

3 結論

以企業(yè)自主選育的霉菌Mxzd-001 作為生產(chǎn)菌種制備一種高產(chǎn)糖化力霉菌麩曲，并應用到濃香型白酒生產(chǎn)中，使白酒出酒率得到明顯提高。本研究通過單因素實驗分析了原料配比和培養(yǎng)條件等對霉菌麩曲糖化力的影響，并結合正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件，確定了該霉菌麩曲的曲料配比中稻殼添加量為10 %，優(yōu)化的適宜培養(yǎng)條件為：時間84 h，溫度35 ℃，水分55%，接種量10%等，培養(yǎng)條件對霉菌麩曲糖化力的影響強弱為：培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間＞水分含量＞接種量。驗證實驗結果表明，優(yōu)化組所培養(yǎng)的霉菌Mxzd-001 麩曲糖化力增加14.7%。該霉菌麩曲應用到濃香型白酒釀造生產(chǎn)中，所產(chǎn)原酒的色譜分析及感官品評結果表明，該霉菌麩曲的應用對濃香型白酒中典型物質含量及白酒風格的影響較小，而濃香型白酒產(chǎn)量提升4.9 %左右。該霉菌麩曲的應用效果明顯，表明曲霉Mxzd-001 具有較高的潛在生產(chǎn)應用價值，為進一步探究多菌種混合麩曲的制備與應用等提供了參考依據(jù)。

表5 白酒品評記錄表