（1.中國長城葡萄酒有限公司技術中心，河北懷來 075400；2.農業(yè)農村部釀酒葡萄加工重點實驗室，河北懷來 075400）

葡萄酒作為一種低酒精度的發(fā)酵酒，不僅具有愉悅的口感和優(yōu)雅的香氣，還含有多種功能保健成分，在當今社交和家庭消費中占據重要的位置。近年來，隨著葡萄酒文化的大力傳播，葡萄酒消費進入了多元化時代，據國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）統計，2018 年中國葡萄酒消費17.9 億升，人均消費1.5 升，成為全球第五大葡萄酒消費國。在葡萄酒消費白熱化的同時，也要關注其安全風險。葡萄酒在發(fā)酵過程中也會產生一些潛在的有害物質，如果控制不當，會對消費者帶來健康風險。本文主要介紹葡萄酒中氨基甲酸乙酯、生物胺、赭曲霉毒素A 3種有害物質的形成機制、危害、限量、檢測方法、防控措施和在中國葡萄酒中的分布情況，提升消費者的安全意識，規(guī)避風險，促進葡萄酒向安全優(yōu)質方向發(fā)展。

1 氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC），其化學分子式為C3H7NO2，分子量為89.09，化學結構見圖1。EC 是煙草葉及香煙的天然成分，也是發(fā)酵食品和酒精飲料在發(fā)酵和貯存過程中天然的伴隨產物[1]。EC 具有致癌性、口服毒性，同時具有多位點致癌性，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病[2]，2007 年被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer）由2B 類致癌物升級為2A類致癌物，并限制了其使用范圍[3]。

圖1 氨基甲酸乙酯化學結構

葡萄酒作為一種發(fā)酵類的酒精飲料，在發(fā)酵過程中會產生EC。2002 年聯合國糧食及農業(yè)組織確定EC為重點監(jiān)控物質，并制定了國際標準：規(guī)定葡萄酒中其質量濃度不得超過20 μg/L[4]。其他國家也制訂了標準限量：加拿大和美國佐餐葡萄酒中EC 的限量不得超過30 μg/L 和15 μg/L[5]。中國目前尚未制訂EC 限量標準，2019 年國家市場監(jiān)管總局已經下發(fā)計劃并立項，制訂《食品安全國家標準酒中氨基甲酸乙酯污染控制規(guī)范》，另外有關機構已經對葡萄酒中EC 進行風險監(jiān)控多年，正在為標準的出臺積累數據。

1.1 EC的形成途徑

酒精飲料中EC的形成有5 條途徑,葡萄酒中主要有3 種途徑：氨甲酰化合物（尿素、氨基甲酰磷酸、瓜氨酸等）和乙醇的反應、焦炭酸二乙酯與氨反應、氰化物與乙醇反應。Uthurry 等[6]研究表明，葡萄酒中EC主要由酵母代謝分泌的尿素和乙醇自發(fā)作用形成，所以尿素被認為是EC 的主要前體物質。葡萄種植期間施的含氮肥料、葡萄酒發(fā)酵過程中添加含氮輔料，以及酵母自身代謝均會形成尿素，有研究證明尿素與乙醇溶液在室溫條件下反應72 h 即可生成EC，氨基甲酰磷酸和乙醇溶液在室溫條件下反應8 h 即可生成EC[7]。來源于酵母和蘋果酸-乳酸發(fā)酵的焦炭酸二乙酯與氨反應也可產生EC[8]。對于白蘭地等蒸餾酒，氰化物是前體物質，其經過氧化再與乙醇反應生成EC[9]。

尿素與乙醇反應：H2NCONH2+C2H5OH→H2NCO2C2H5+NH3。

焦炭酸二乙酯通過與氨反應：O(CO2C2H5)2+NH3→H2NCO2C2H5+CO2+C2H5OH。

氰化物與乙醇反應：HNC→HOCN；HOCN+C2H5OH→H2NCO2C2H5。

1.2 EC的影響因素及控制措施

影響葡萄酒中EC 含量的因素有前體物質含量、乙醇濃度、pH 值、溫度和貯存時間。所以從防控措施上，首先控制前體物質含量，要監(jiān)控葡萄種植土壤、葡萄樹、葡萄汁中含氮情況，限定葡萄含氮量。根據研究，建議發(fā)酵前的葡萄汁中可同化氮推薦值為267 mg/L，精氨酸含量不超過1000 mg/L[10]；選擇尿素產出低的酵母，合理使用氮類加工助劑；第二，控制EC 形成的反應速率，相關研究表明，溫度對EC的形成有重要的促進作用，在貯存期間，葡萄酒中的乙醇還會繼續(xù)和尿素反應生成EC，要建立合適的貨架期。研究表明葡萄酒貯藏溫度從20 ℃上升到40 ℃，EC 產生速率上升20～40 倍[10]。對黃酒中EC貯存溫度研究發(fā)現，EC含量為74 μg/L的黃酒，分別在室溫和37 ℃下貯存400 d，EC 分別達到了131.8 μg/L 和509.4 μg/L[11]。在葡萄酒貯存和運輸過程中，盡量保持低溫避光的環(huán)境條件，溫度在15～25 ℃，切不可超過35 ℃；pH 值升高，EC含量也會升高，所以要合理控制pH 值[12]；可添加脲酶去除部分EC，但要符合法規(guī)要求。

1.3 EC在葡萄酒中分布情況

近年來，隨著業(yè)內人員對EC的關注，一些國家機構、國家和地方疾控中心以及研究部門開展了對葡萄酒EC的抽檢。新疆農業(yè)大學和新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心對53 份新疆市售地產葡萄酒中的EC 含量進行檢測，EC 含量范圍為3.2～291.2 μg/L，平均含量30.0 μg/L，介于0～60 μg/L的樣品累積頻率達到92.4%[13]，絕大部分高于加拿大和美國的標準，具有較高的污染風險；甘肅省疾病預防控制中心對甘肅省內市售的50 份葡萄酒樣品檢測中，EC 檢出率為98 %，污染水平為1.92～25.81 μg/L，平均值為9.88 μg/L[14]，低于加拿大的限量標準；朱亞楠等人采用SPE 結合GC-MS 法對我國煙臺、沙城、昌黎、新疆四大產區(qū)的葡萄原酒中EC 含量進行檢測，結果顯示EC 含量范圍是2.12～13.05 μg/L，平均值為5.65 μg/L[15]，表明原酒中EC含量處在較低的水平。

1.4 EC的檢測方法

目前檢測EC 主要使用氣相色譜質譜法（GCMS），靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性強，根據GB 5009.223—2014 規(guī)定[16]，待測樣品經過處理加入內標，通過固相萃取、真空濃縮后進行上機檢測。周勇等[17]通過對方法細節(jié)的優(yōu)化建立了氣質聯用測定酒類中EC 的方法，在樣品前處理和方法探索上有指導意義。

除此之外常用方法還有高效液相色譜熒光檢測器法（HPLC-FLD），但靈敏度不如GC-MS 高，不過操作較前種方法簡單。陳達煒等[18]利用HPLCFLD 檢測葡萄酒中的EC，平均加標回收率在93.7 %～106.0 %之間，RSD 在1.4 %～2.8 %之間，通過與GC-MS 方法相比較，EC 含量測定結果無明顯差異，適合葡萄酒中EC的快速測定。

2 生物胺

生物胺（Biogenic Amines,BAs）是一類低分子量的含氮化合物，存在于動物源食品、發(fā)酵類等多種食品中，包括葡萄酒[19-21]。過量的BAs 攝入會對人體產生很大危害，引起頭痛、血壓升高、呼吸紊亂、心悸、嘔吐、皮疹等嚴重反應，組胺是生物胺中毒性最大的，過量的組胺會導致頭痛、消化障礙及血壓異常，甚至會引起神經性毒性；酪胺的毒性次之，過量也會引起頭痛和高血壓等反應[22-25]。在葡萄酒中，乙醇與尸胺、腐胺能抑制組胺脫氫酶、二胺氧化酶和單胺氧化酶的活性，從而增加組胺的含量，同時乙醇會促進組氨酸脫羧基形成組胺。

葡萄酒中常見的生物胺有8 種,如表1 所示，根據其結構分為3 類：脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等)，芳香族(酪胺、苯乙胺等)，雜環(huán)族(組胺、色胺等)[26]。許多國家已經規(guī)定了葡萄酒中組胺的限量：澳大利亞和瑞士規(guī)定葡萄酒中的組胺含量不得高于10 mg/L，法國規(guī)定不得高于8 mg/L，荷蘭規(guī)定不得高于3.5 mg/L，德國規(guī)定不得高于2 mg/L[27]。中國目前對葡萄酒中生物胺限量還沒有規(guī)定，但有關組織和機構已經對市場葡萄酒生物胺的風險持續(xù)多年監(jiān)控中。

表1 葡萄酒中的常見生物胺及分子量、分子式及化學結構

2.1 葡萄酒中BAs的形成

BAs 形成必須具備3 個基本條件：第一是具有可利用的自由氨基酸作為產生生物胺的前體物質；第二是含有能夠分泌氨基酸脫羧酶的微生物；第三是處于有利于微生物的生長、氨基酸脫羧酶的合成和提高脫羧酶活性的適宜環(huán)境條件[28]。對于葡萄酒中生物胺主要通過兩個過程產生：一是乳酸菌主導的蘋果酸-乳酸發(fā)酵工藝，是BAs 主要的來源途徑，二是酵母菌主導的酒精發(fā)酵工藝。葡萄原汁還未發(fā)酵時存在一些低濃度的胺類物質，在發(fā)酵過程中酵母菌能降解部分生物胺，經過蘋果酸-乳酸發(fā)酵后，乳酸菌會將相應的氨基酸脫羧后形成組胺、酪胺、腐胺、尸胺和苯乙胺等生物胺[29]。

2.2 BAs影響因素及控制措施

葡萄酒中的BAs 含量與葡萄品種、氣候條件、葡萄衛(wèi)生狀況、酒種、釀造工藝、貯存條件等諸多因素相關[30]。不同的葡萄原料有不同種類和量的氨基酸和生物胺，Wang等[31]發(fā)現有6種生物胺（乙胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺及亞精胺）在葡萄汁中，他們的含量與葡萄品種、成熟度、土壤類型和成分有關；Vasco 等[32]對新酒、陳釀原酒和瓶儲原酒3 個階段BAs檢測，發(fā)現隨著陳釀時間的延長總生物胺呈現降低趨勢；蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）工藝是影響B(tài)As 形成的主要因素，乳酸菌的選擇，發(fā)酵過程pH值的高低，SO2的含量均與BAs 的形成有關，另外白葡萄酒中BAs含量和種類要低于紅葡萄酒，主要原因是大部分白葡萄酒不進行MLF 工藝；酒泥陳釀也會增加BAs的風險。

BAs 的防控措施主要從三個方面控制：一是MLF盡量使用商業(yè)的乳酸菌，并選擇生物胺相關基因缺失的乳酸菌，不要利用野生乳酸菌自然啟動發(fā)酵；二是減少生物胺前體物質，控制原料中的氮源，避免形成過多的氨基酸；三是控制發(fā)酵條件，如pH值、發(fā)酵溫度、浸漬時間和方式、陳釀以及貯存等。

2.3 BAs在中國葡萄酒中分布情況

BAs 在中國已經被多家檢測機構和科研院所調查研究，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院李志軍等[33]抽查了市售的國產250個樣品，組胺檢出率為52.8%，98.8%的葡萄酒樣品中組胺和酪胺含量低10 mg/L，低于澳大利亞的標準，檢出率最高的是腐胺為88.4 %，檢測值范圍為0～46 mg/L，整體良好；Ke等[34]對中國市場銷售的456 個葡萄酒樣品抽查分析，發(fā)現組胺的檢出率為59 %，檢測值范圍為0～22 mg/L，最高值高于澳大利亞、法國等標準，酪胺的檢出率為89%，檢測值范圍為0～21 mg/L，最高是腐胺，檢出率98.5%，檢測值范圍為0～34 mg/L?？梢妵鴥仁袌錾箱N售的葡萄酒仍有少部分的葡萄酒組胺的限量超出國外的標準，需要不斷的檢測和引導企業(yè)制定BAs防控措施，為限量標準的出臺奠定基礎。

2.4 檢測方法

2.4.1 毛細管電泳法

毛細管電泳（Capillary Electrophoresis,CE），是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，根據樣品中各組分之間電泳速度和分配行為上的差異而實現分離[35]。曹麗偉等[36]利用合成的6-氧-[(1-琥珀酰亞胺)氧酰甲基]-熒光素乙酯(SOFE)作為柱前衍生試劑，毛細管電泳分離-激光誘導熒光檢測生物胺，6 種生物胺在15 min 內完全分離，回收率在93 %～101 %之間，RSD 在0.8 %～4.3 %之間，檢出限在2.5×10-11～8×10-11mol/L 之間，該方法靈敏度高，簡單便捷。張桂森[37]使用毛細管電泳-連續(xù)多光子激發(fā)熒光檢測組胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、苯乙胺6 種常見生物胺，雖然在靈敏度上不如單光子檢測，但是分離效率高、檢測體積小，適用于復雜體系中生物胺檢測。

2.4.2 液相色譜法

相較于上述毛細管電泳法，液相色譜法的前處理過程很復雜，同時也是這種方法的關鍵步驟，對生物胺的分離提取，目前使用廣泛的是成本相對較低、操作沒有液液萃取那么繁瑣的固相萃取。張文豪等[38]采用鄰苯二甲醛/巰基乙胺混合溶液為衍生化試劑，利用反相高效液相色譜法在25 min內測定葡萄酒中組胺、尸胺、腐胺、酪胺、色胺、精胺、亞精胺和β-苯乙胺8 種生物胺，回收率在91.2 %～104.1 %之間，RSD＜5 %，檢出限在20～100 μg/L之間，靈敏度高，重現性好，適用于葡萄酒中生物胺的檢測。

2.4.3 生物傳感器法

生物傳感器法是利用酶等物質作為傳感器的識別部分，與樣品中的生物胺發(fā)生一定反應，將其轉換成檢測器可識別的信號，從而對生物胺進行定性和定量分析。唐晗等[39]利用生物傳感器法測定食品中生物胺，芯片設計使用的是成本低且操作簡單的以聚甲基丙烯酸甲酯為原料的微流控芯片，結合固定化二胺氧化酶識別元件，通過流動分析法來檢測食品中生物胺的總量，此傳感器靈敏度高、酶柱儲存時間長、回收率高，適用于食品中生物胺快速檢測。

3 赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素(Ochratoxins)是異香豆素連接β-苯基丙氨酸上的衍生物，有A、B、C、D 共4 種，其中赭曲霉毒素A（Ochratoxins A,OTA）分布最廣，毒性最強，具有很高的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,半衰期較長，化學結構見圖2。OTA分布于多種食品中，現在被食品添加劑聯合專家委員（JECFA）認定的對OTA暴露風險最大的7種食品是谷物、谷物制品、葡萄酒（汁）、咖啡、可可制品、啤酒、豬肉。OTA 可產生致畸、致癌，對人體腎臟、肝臟、神經有毒性，會加速細胞衰老，影響免疫力[40-42]。1993年，OTA被國際癌癥研究機構(IARC)歸類為2B類致癌物[43]，然而最近由于發(fā)現新的毒理基因信息（OTA 的DNA 加合物）在氧化應激中的作用和遺傳因子的識別,OTA 被上升為2A 類致癌物[44]。世界葡萄與葡萄酒（OTV）和歐盟建對葡萄酒限量標準定為2 μg/kg[45]。中國食品安全國家標準《食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)中OTA限量標準定為2 μg/kg[46]。

3.1 OTA的形成及影響因素

圖2 OTA化學結構

OTA是一種來源于生產原料的生物毒素，其產生主要與作物的生長環(huán)境相關，主要與土壤中微生物、環(huán)境溫濕度、以及作物病蟲害感染情況等相關[47]。導致OTA 感染的菌主要是疣孢青霉(Penicillium Vcrrugogum)、赭曲霉（Aspergilhs Ochraceus）、炭黑曲霉（Aspergilhs Carbonarius）3 種微生物，其中炭黑曲霉主要侵染葡萄等水果[48]。當葡萄果實因為物理、化學、致病微生物等原因導致表面破損，炭黑曲霉會侵入果實內部，生長繁殖，產生OTA。

氣候變化、葡萄園地理位置和葡萄的健康程度被認為是葡萄中產生OTA 的決定因素[49]，研究發(fā)現，環(huán)境溫度與葡萄和葡萄酒中OTA 的分布呈正相關，環(huán)境溫度較高的南歐國家的葡萄酒中OTA高于環(huán)境溫度低的北歐國家[50]，另外來自意大利、西班牙的高溫產區(qū)葡萄酒樣品中OTA 高于2 μg/L的樣品達到10 %[51]。葡萄品種和釀造工藝也影響OTA 的產生，紅葡萄酒的帶皮浸漬會增加OTA 的產生[52]，因此OTA 多見于紅葡萄酒，其次是桃紅葡萄酒和白葡萄酒。

3.2 OTA的防控措施

對于葡萄和葡萄酒中OTA 的防控措施，首先要選擇葡萄園的位置，葡萄園應建立在良好的空氣循環(huán)空間和避免潮濕地區(qū)；其次有條件可以研究培育抵抗力較強的葡萄品種或品系；三是做好葡萄園田間的管理，保持葡萄果穗良好通風、控制病蟲害、避免靠近有真菌微生物的土壤；四是葡萄采收中保持葡萄完整健康、做好運輸的衛(wèi)生管理，分選出不健康有病害的葡萄串或葡萄果實，對于病害嚴重的葡萄酒，縮短浸漬時間，快速壓榨，并對葡萄汁過濾澄清?？衫靡恍┪锢砗突瘜W方法降低葡萄和葡萄酒中OTA，如紫外線照射可以有效抑制炭黑曲霉的生長與產毒；在白葡萄酒中可以使用活性炭吸附來消除OTA。

3.3 OTA在中國葡萄酒中分布情況

中國食品發(fā)酵研究院Zhong 等[53]檢測了國產183 個紅葡萄酒和40 個白葡萄酒中OTA，檢測范圍分別為0～0.20 μg/kg 和0～0.36 μg/kg，之間，遠低于歐盟和中國OTA 的限量標準；全莉等[54]采用酶聯免疫法檢測分析我國新疆不同產區(qū)葡萄酒中OTA含量，結果顯示，56.25 %的樣品檢出OTA，含量均未超過2 μg/kg，同時發(fā)現紅葡萄酒中的OTA 含量明顯高于白葡萄酒，且產區(qū)不同葡萄酒中的OTA含量也不同；王興龍等[55]采用穩(wěn)定同位素直接稀釋/超高效液相色譜-串聯質譜法，對國內市售的國產品牌15 種紅葡萄酒和5 種白葡萄酒進行檢測，所有樣本中均未檢出OTA，說明中國葡萄酒OTA 含量風險程度較低，安全性良好。

3.4 檢測方法

常用檢測OTA 的方法有固相萃取-高效液相色譜法（SPE-HPLC）。宗楠等[56]通過這種方法對國產葡萄酒進行了實驗研究，優(yōu)化了上樣體積、淋洗液條件、色譜條件，優(yōu)化后方法的回收率在94.6%～99.5%之間，RSD 在0.36%～3.01%之間，適合國產葡萄酒中OTA的檢測。

4 結束語

本文綜述了葡萄酒中氨基甲酸乙酯、生物胺、赭曲霉毒素A 3 種潛在有害物質的危害、形成、常用檢測方法、控制措施、在國內葡萄酒中的分布情況。目前葡萄酒生產企業(yè)越來越多，葡萄酒品質良莠不齊，上述3 種有害物質的風險也越來越高，應盡快制定相關國家標準，監(jiān)管部門嚴格把關，也希望可以提高葡萄酒消費者的安全意識，督促生產企業(yè)對于這些有害物質加強控制管理，促進我國葡萄酒發(fā)展更加優(yōu)質安全。