侯 玥，崔 莉，于紅霞，趙恒強，王 曉，王岱杰

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測試中心，濟(jì)南250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250014；3.威海金頤陽藥業(yè)有限公司，威海264200)

病毒肺炎是臨床常見的傳染性呼吸道疾病。西醫(yī)目前尚無針對病毒性肺炎的特效藥，臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，病毒性肺炎的嚴(yán)重程度與病毒和機體炎癥反應(yīng)的強度相關(guān)，重癥肺炎產(chǎn)生的原因是感染誘發(fā)了機體產(chǎn)生過度的免疫應(yīng)答，因而對病毒性肺炎的免疫治療顯得尤為重要[1]。中醫(yī)藥在免疫調(diào)節(jié)、防治病毒性肺炎方面有明顯的優(yōu)勢[2]，已報道多種特色中醫(yī)方劑治療病毒性肺炎的臨床療效[3]。但是中醫(yī)理論指導(dǎo)預(yù)防病毒性肺炎的用藥研究還較少。以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，從中藥中尋找高效、安全的免疫調(diào)節(jié)劑對于病毒性肺炎的臨床防治是一個重要的手段。

西洋參為五加科人參屬重要的名貴中藥，其藥理作用已有了廣泛報道，包括抗腫瘤和病毒、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和免疫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心肌保護(hù)等[4]，其中免疫調(diào)節(jié)作用是其重要的功效，西洋參中皂苷、多糖等多種主要活性成分均具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，如西洋參總皂苷能刺激骨髓干細(xì)胞和脾細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)脾細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-3和白細(xì)胞介素-6樣物質(zhì)，還能調(diào)控脾細(xì)胞中造血生長因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)骨髓干細(xì)胞增殖[5]。西洋參在中藥復(fù)方配伍中也發(fā)揮著提高免疫的作用[4]，《新型冠狀病毒肺炎診療方案》推薦使用的中藥復(fù)方中也有西洋參[6]，2020年1月國家衛(wèi)健委將西洋參納入按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點[7]，作為具有調(diào)節(jié)免疫功效的藥食兩用中藥材，西洋參防治病毒性肺炎具有開發(fā)潛力和廣闊前景。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是運用系統(tǒng)生物學(xué)、高通量篩選等多種技術(shù)，從整體性與系統(tǒng)性的角度探析藥物對機體疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，通過構(gòu)建“疾病-基因-靶標(biāo)-藥物”等關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，可有效預(yù)測藥物功能，從而闡明中藥多成分、多靶點、多通路的特征，是目前中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要手段之一。因而本研究發(fā)揮中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探究西洋參預(yù)防病毒性肺炎的可能性及相關(guān)分子機制，以期為開發(fā)西洋參防治免疫疾病的系列功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 西洋參活性成分

基于中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP[8]及文獻(xiàn)檢索，篩選西洋參的主要入血活性成分。根據(jù)TCMSP平臺推薦的參數(shù)，設(shè)置篩選條件為：口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。

1.2 預(yù)測目標(biāo)靶點

TCMSP及文獻(xiàn)中檢索的入血活性成分用Pub-Chem[9]確定結(jié)構(gòu)，并下載smiles標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)式。將smiles標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)式輸入SwissTargetPrediction[10]工具預(yù)測化合物靶點集合，選擇Probability＞0.02的靶點，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.1并分析數(shù)據(jù)，繪制西洋參-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。用GeneCard[11]數(shù)據(jù)庫檢索病毒性肺炎的相關(guān)靶點，以“Viral pneumonia”、“pneumonia”、“cytokine release syndrome”[1]為關(guān)鍵詞，收集病毒性肺炎的靶點集合；取西洋參化合物和病毒性肺炎兩集合的靶點交集作為目標(biāo)靶點。

1.3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

目標(biāo)靶點輸入STRING[12]工具用以構(gòu)建目標(biāo)靶點蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.1繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape3.7.1插件CytoHubba篩選重點靶點。CytoHubba提供了11種拓?fù)浞治龇椒?，包括Degree（度值），EPC（邊過濾成分），MNC（最大鄰域分量）等基于最短路徑的計算方法；本研究依據(jù)給定的重要性概念和網(wǎng)絡(luò)中心性對節(jié)點進(jìn)行排名，選取MCC（最大集團(tuán)中心性）分析方法，重點靶點數(shù)設(shè)為Top20。

1.4 GO和KEGG富集分析

將目標(biāo)靶點列表導(dǎo)入DAVIDE[13]工具，選擇基因本體論（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）和遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（GAD）分別進(jìn)行通路和疾病的富集分析，基因本體論（GO）富集分析包括分子功能（MF），生物過程（BP）和細(xì)胞成分（CC）三類條目。結(jié)果用Excle和Cytoscape3.7.1展示。

2 結(jié)果和分析

2.1 西洋參的活性成分

按照1.1的篩選條件，共篩選出西洋參的主要入血活性成分14個，其中8個基于TCMSP平臺得到。文獻(xiàn)檢索得到西洋參主要活性成分為：人參皂苷Rb1、Rg1和Re[14]，根據(jù)人體的代謝動力學(xué)，人參皂苷Rb1降解迅速，人參皂苷Rd、Rg3、Rh2等中間產(chǎn)物及代謝終產(chǎn)物20（s）-原人參二醇是24h后仍可以檢測到的入血成分[15]。人參皂苷Re的最終入血成分有人參皂苷Re、Rg1和人參三醇[16-17]。因此，人參皂苷Rd、Rg3、20（s）-原人參二醇、Re、Rg1和人參三醇雖然沒有達(dá)到TCMSP的篩選條件，但作為西洋參的主要成分和代表性入血活性成分，也納入研究。綜上所述，通過TCMSP平臺獲得8個活性化合物，文獻(xiàn)檢索獲得6個活性化合物，共獲得西洋參活性化合物14個，詳見表1。

表1 西洋參的活性成分Table 1 Active ingredients of AG

2.2 西洋參的靶點分析

通過SwissTargetPrediction工具預(yù)測西洋參活性成分的靶點313個，繪制西洋參-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖見圖1，圖中圓圈節(jié)點代表化合物預(yù)測的靶點，V節(jié)點代表化合物，8邊形節(jié)點代表西洋參，節(jié)點越大代表度值越大即與該靶點相連的化合物越多。從圖1可見基于不同化合物共同的靶點，西洋參的化合物成分具有明顯的分群，14個化合物被分成4組。每組中呈圈狀排列的靶點是圈內(nèi)化合物的共同靶點，每組中矩狀排列的靶點為該組內(nèi)某一個或某兩個化合物單獨或重合的靶點，組間共同靶點位于中央呈矩狀排列。組①中的聚乙炔類揮發(fā)性成分PQ-2和PQ-2和人參三醇的靶點重合較多，組②的甾醇類化合物（7-去氫豆甾醇、β-谷甾醇1和β-谷甾醇2）和20（s）-原人參二醇的靶點重合較多，組④的人參皂苷Rd、Rg3、Rh2、Re、Rg1和F2，這六個皂苷類化合物的靶點重合較多?；衔锓秩旱脑蚩赡苁墙Y(jié)構(gòu)相似的化合物擁有相同的官能團(tuán)。

其中人參皂苷類化合物是西洋參的主要成分，因此皂苷類化合物的靶點代表了西洋參的主要藥理作用。皂苷類化合物的共同靶點包括RORC（人類核受體ROR-γ）、IL2（白細(xì)胞介素2）、PSENEN（早衰蛋白增強子2）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長因子A）、LGALS3（重組人半乳糖凝集素3）、FGF1（成纖維細(xì)胞生長因子1）、APH1A（前咽部缺陷1同源物A）、LGALS8（重組人半乳糖蛋白8）、PSEN2（早衰蛋白2）、STAT3（信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3）、NCSTN（呆蛋白）、HPSE（乙酰肝素酶）、ATP1A1（鈉鉀ATP酶α1肽）、FGF2（成纖維細(xì)胞生長因子2）、PTAFR（血小板活化因子受體）、APH1B（前咽部缺陷1同源物B）、LGALS4（人半乳糖凝集素4）、PSEN1（早老素1）、BCL2L1（B淋巴細(xì)胞瘤-2）、HSP90AA1（90KDA熱休克蛋白AA1）。

RORC、IL2、STAT3是參與免疫調(diào)節(jié)的主要分子。RORC的重要作用表現(xiàn)在調(diào)節(jié)Th17極化和功能以及胸腺細(xì)胞發(fā)育[18]，IL2是是T細(xì)胞代謝程序的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，通過控制關(guān)鍵細(xì)胞因子受體、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑和效應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)來控制CD4+T細(xì)胞的分化和功能[19]。STAT3在控制免疫中起關(guān)鍵信號傳遞作用，可以調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫，誘導(dǎo)IL-17產(chǎn)生（Th17）細(xì)胞。此外，還能調(diào)控巨噬細(xì)胞中的抗炎信號傳導(dǎo)[20]。另外FGF-1有輔助免疫的協(xié)同增效功能，F(xiàn)GF-1和抗CD3共刺激T細(xì)胞后產(chǎn)生IL-2明顯高于單獨使用CD3刺激T細(xì)胞[21]。西洋參主要成分人參皂苷類化合物的主要靶點中有調(diào)節(jié)免疫和炎癥關(guān)鍵過程的相關(guān)分子，證明西洋參在提高免疫方面的價值。

圖1 西洋參-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 AG-compound-target network

圖2 西洋參-④組成分-共同靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 AG-④components-common target-pathway-disease network diagram

本研究將西洋參皂苷（組④成分）的靶點進(jìn)行了疾病富集分析，預(yù)測分析西洋參治療疾病的潛力。“西洋參-組④成分-共同靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西洋參在治療自身免疫性疾病方面具有潛力，包括多發(fā)性硬化、銀屑病關(guān)節(jié)炎、糖尿病，同時西洋參對于治療人體免疫相關(guān)其余疾病也有潛力，如胃腫瘤，霍奇金病，白血病。因此，從調(diào)控免疫的潛力方面分析，西洋參防治病毒性肺炎有一定可行性，同時西洋參對炎癥和癌癥相關(guān)通路，以及阿爾茲海默病的治療潛力，有待于進(jìn)一步研究。

2.3 目標(biāo)靶點及PPI網(wǎng)絡(luò)

GeneCard數(shù)據(jù)庫收集病毒性肺炎的相關(guān)靶點共1265個，將西洋參的313個靶點與之進(jìn)行映射，得到共同靶點120個，繪制韋恩圖見圖3。這120個靶點即為西洋參防治病毒性肺炎的目標(biāo)靶點，目標(biāo)靶點占西洋參靶點的39%，因而日常服用西洋參提高免疫力對預(yù)防病毒性肺炎有一定意義。

將120個目標(biāo)靶點輸入STRING工具，構(gòu)建目標(biāo)靶點的蛋白質(zhì)互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖4，共有120個節(jié)點，1440條邊，節(jié)點越大，顏色越冷代表度值（Degree）越大；邊越粗，顏色越冷代表結(jié)合分?jǐn)?shù)（combinedscore）越高。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1并用CytoHubba插件篩選重點靶點見圖5，節(jié)點越大代表度值越大，節(jié)點越紅代表MCC算法后的分值越高。重要的靶點有STAT3（信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3）、MAPK3（絲裂原活化蛋白激酶3）、EGFR（表皮生長因子受體）、MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）、VEGFA（血管內(nèi)皮生長因子A）、BCL2L1（B細(xì)胞淋巴瘤2）、CASP3（胱天蛋白酶3）、MTOR（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）、MAPK8（絲裂原活化蛋白激酶8）、ESR1（雌激素受體1）、PTGS2（前列腺素內(nèi)過氧化物合酶）、IGF1R（胰島素樣生長因子1受體）、TNF（腫瘤壞死因子）、AKT1（絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶）、AR（醛糖還原酶）、HSP90AA1（90KDA熱休克蛋白AA1）、MAPK14（絲裂原活化蛋白激酶14）、FGF2（成纖維細(xì)胞生長因子2）、MAP2K1（促分裂原活化蛋白激酶激酶1）、HIF1A（缺氧誘導(dǎo)因子-1）。

本研究檢索了病毒性肺炎相關(guān)的疾病基因，發(fā)現(xiàn)西洋參與之重合的基因與免疫相關(guān)。CytoHubba篩選的重點靶 點 中STAT3、MAPKs（MAPK3、MAPK1、MAPK8、MAP2K1、MAPK14）、VEGFA、HIF1A、MTOR均與病毒感染有關(guān)。如STAT3信號傳導(dǎo)可以維持病毒感染，刺激病毒基因表達(dá)，抑制干擾素的抗病毒作用，促進(jìn)多種肝炎病毒的疾病進(jìn)程[22-26]。MAPKs家族是一類有應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等重要功能的調(diào)控因子[27]。VEGF表達(dá)的上調(diào)使多種病毒受益。HIF-1α、COX-2、AP1、IL6/MTOR多種通路上調(diào)VEGF表達(dá)，使卡波西氏肉瘤皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、單純皰疹病毒和登革熱病毒等受益于其自身發(fā)病機理的生理功能[28]。綜上，從抗病毒感染靶點方面的相關(guān)性分析，西洋參防治病毒性肺炎具有可能性。

圖3 西洋參和病毒性肺炎映射靶點Fig.3 AG and病毒性肺炎mapping targets（藍(lán)色為病毒性肺炎相關(guān)靶點，紅色為西洋參靶點）

圖4 目標(biāo)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram of the target

圖5 CytoHubba篩選重點靶點Fig.5 CytoHubba screening key targets

2.4 GO和KEGG富集分析

目標(biāo)靶點的基因本體論（GO）富集分析見圖6，結(jié)果顯示生物過程主要包括蛋白質(zhì)改變以及炎癥反應(yīng)，細(xì)胞成分主要涉及質(zhì)膜和細(xì)胞表面，分子功能主要有激酶活性和蛋白質(zhì)結(jié)合。京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析見圖7，KEGG富集分析顯示的條目主要有病毒感染相關(guān)的通路如：乙型肝炎、丙型肝炎、甲型流感、EB病毒感染、麻疹和HTLV-I感染；炎癥相關(guān)通路如：HIF-1信號通路、FcεRI信號通路、PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路和MAPK信號通路；免疫相關(guān)通路如：T細(xì)胞受體信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；以及癌癥相關(guān)的通路如：癌癥的途徑、胰腺癌和Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路等；富集分析的結(jié)果提示了西洋參可能通過影響抗病毒感染、抗炎和調(diào)節(jié)免疫等通路發(fā)揮防治病毒性肺炎的作用。將2.2中的重點靶點進(jìn)行KEGG富集分析，得到西洋參-化合物-重點靶點-通路見圖8，圖7與圖8通路對比如表2（見附頁）所示，可見重點靶點基本代表了西洋參治療病毒性肺炎的主要藥理作用，集中在抗炎和抗病毒感染，同時發(fā)現(xiàn)西洋參有良好的抗癌潛力。

圖6 GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis

圖7 KEGG富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis

圖8 西洋參-化合物-重點靶點-通路Fig.8 AG-Compound-Target-Pathway

近年來，西洋參提高免疫抗病毒的藥理作用及其分子機制的相關(guān)研究已有較多報道。Cesare等[29]的臨床研究表明西洋參提取物可能通過提高人體免疫改善上呼吸道感染，常規(guī)服用西洋參提取物的老年人尤其是高危老年人感冒時癥狀較輕，且痊愈周期時間變短。Liou等[30-31]發(fā)現(xiàn)西洋參（5500μg/mL）能刺激B淋巴細(xì)胞增殖，并增加小鼠脾細(xì)胞中白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-10和干擾素-γ的產(chǎn)生。Miller等[32]報道西洋參可以增加小鼠脾臟和骨髓中的自然殺傷細(xì)胞數(shù)量。

研究顯示人參皂苷Rg3可預(yù)防新生小鼠輪狀病毒感染[33]，還可通過TNF受體相關(guān)因子6/轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1的降解和c-Jun N端激酶/AP-1信號的抑制而表現(xiàn)出抗乙型肝炎病毒活性[34]，Rg3可通過降低p21來抑制丙型病毒肝炎的增殖[35]。Lee等[36]發(fā)現(xiàn)人參皂苷處理的FRhK-4細(xì)胞甲型肝炎病毒的感染降低。Jeong[37]等證明人參皂苷Rh1可能通過抑制PDK1/Akt途徑消除HIV-1感染的細(xì)胞保護(hù)性巨噬細(xì)胞。人參皂苷Rg1增強Th1（IgG2b和IFN-γ）和Th2（IgG1和IL-4）的響應(yīng)，提高免疫應(yīng)答對抗乙型肝炎病毒[38]，Rg1通過降低促炎細(xì)胞因子（包括IL-1β，IL-8，IL-6和TNF-α）的mRNA水平和抑制病毒感染觸發(fā)的NF-κB信號通路[39]，發(fā)揮抗2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒活性。人參皂苷Rb1或Rg1預(yù)處理可以誘導(dǎo)貓杯狀病毒感染的CRFK細(xì)胞抗病毒蛋白IFN-α，IFN-β，IFN-ω的表達(dá)，降低病毒滴度[40]?？梢娙藚⒃碥疹惓煞帜芡ㄟ^阻斷病毒感染、抑制病毒代謝過程和免疫調(diào)節(jié)等多途徑發(fā)揮其廣譜抗病毒效果。

同時富集的結(jié)果發(fā)現(xiàn)西洋參可能通過免疫及癌癥等途徑預(yù)防病毒引起的肺炎。起源于20世紀(jì)初的病毒致癌學(xué)說[41]就提出了病毒感染和癌癥的相關(guān)性，最近的研究也發(fā)現(xiàn)了病毒致癌的證據(jù)，代謝重編程可能是病毒致癌的機制[42]，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞有相似的代謝改變。西洋參抗癌作用有廣泛的報道，西洋參的皂苷可以對抗乳腺癌[43]、肺癌[44]、大腸癌[45]、前列腺癌[46]等多種癌癥。病毒感染人體后的代謝變化與腫瘤相似，因而也可以推測用西洋參調(diào)節(jié)人體代謝環(huán)境，營造不利于病毒復(fù)制生存的環(huán)境可能有助于預(yù)防病毒性肺炎，這與中醫(yī)理論“正氣存內(nèi)，邪不可干”有極高的相似性，這將是未來研究的重要方向。

3 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出西洋參的主要入血活性成分14個，其中8個為人參皂苷類化合物，人參皂苷的靶點重合度很高，其主要靶點的藥理作用基本代表了西洋參的藥理作用，分析得到其藥理學(xué)作用包括提高免疫、抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。西洋參全部靶點的39%與病毒性肺炎相關(guān)，富集分析的條目包括病毒感染相關(guān)途徑、免疫和炎癥相關(guān)的通路、癌癥相關(guān)的通路。癌癥和病毒感染激活的生物合成途徑相似，西洋參在人體的作用機制以抑制腫瘤為主，可以調(diào)節(jié)人體的代謝環(huán)境向不利于腫瘤發(fā)生發(fā)展的方向前進(jìn)，這種環(huán)境同樣也不利于病毒復(fù)制。因此，西洋參在抗病毒感染、抗炎和調(diào)節(jié)免疫方面具有防治病毒性肺炎的潛力。