律廣富，樸永革，黃曉巍，李寶志，林 賀，李岳宸，李元實(shí)，馬 超，莊雪峰，林 喆

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春130117；2.吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，長(zhǎng)春130031；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春130117）

咳嗽變異性哮喘（CVA），是一種特殊類型的哮喘，屬于哮喘的一種，但也有認(rèn)為其屬于咳嗽的一種[1]，發(fā)病時(shí)間多集中在秋冬交接時(shí)間，但也存在全年發(fā)病病例。國(guó)醫(yī)大師王烈教授認(rèn)為本病發(fā)病機(jī)制及特點(diǎn)與哮喘相似，但與哮喘的喘息氣促之癥又不完全相同，因此將其命名為“哮咳”[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明咳嗽變異性哮喘的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，多是內(nèi)因外邪協(xié)同導(dǎo)致，為咳嗽變異性哮喘的治療提供了新思路。中醫(yī)認(rèn)為風(fēng)、痰、熱、寒、淤是誘發(fā)咳嗽變異性哮喘的關(guān)鍵[3]。西醫(yī)認(rèn)為咳嗽變異性哮喘患者多表現(xiàn)為肺部炎癥及免疫功能失調(diào)，導(dǎo)致肺臟功能失調(diào)，而發(fā)生慢性咳嗽[4]。

人參為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其性甘、溫、平；味微苦；主要?dú)w脾、肺經(jīng)、心經(jīng)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，人參在抗氧化應(yīng)激、抗炎等方面能夠發(fā)揮作用[5]，在腫瘤抑制、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管等方面均證明有顯著療效[6]。由于人參主歸肺經(jīng)，又具有補(bǔ)氣生津作用，現(xiàn)代研究證明人參在治療支氣管哮喘、小兒哮喘等肺部疾病方面療效顯著[7-9]。但在咳嗽變異哮喘治療方面研究較少。石菖蒲化濕、開(kāi)竅、豁痰，主要用于治療痰迷心竅，驅(qū)濕熱、濕溫，在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管方面及腫瘤治療均有一定報(bào)道[10]。因此本文將人參及石菖蒲聯(lián)用，探究其對(duì)咳嗽變異性哮喘的作用，作為該疾病預(yù)防治療的理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，60只，體質(zhì)量180～200g，購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（吉）-2018-0003。

1.2 藥品與試劑

人參（吉林國(guó)安藥業(yè)有限公司，20181101）；石菖蒲（吉林國(guó)安藥業(yè)有限公司，20180201）；醋酸地塞米松片（遂成藥業(yè)股份有限公司，H41021038，規(guī)格0.75mg/片）；卵清蛋白（Sigma，#SLBS6919）；氯化鈉注射液（吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司，H22023069）；IL-4（批號(hào)：20200924）、IL-6（批號(hào)：20200924）、IFN-γ（批號(hào)：20200924）、IgE（批號(hào)：20200924）試劑盒（購(gòu)自南京建成生物研究所有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平（福州華志儀器有限公司）；JA2003B電子分析天平（上海越平儀器公司）；JSC-202超聲霧化器（遼寧鞍山電子醫(yī)療儀器廠）；粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器公司）；WP-UP-III-40精密型超體純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；4℃低溫離心機(jī)（Cerrtrifuge 5810R）；EYEL4 SLI-700恒溫培養(yǎng)箱（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；BC-5300Vet血細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療）；MultiskanFC型酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備

人參石菖蒲提取物的制備：取人參與石菖蒲粉碎機(jī)粉碎，按2∶1混合，70%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收乙醇并濃縮至浸膏[11]，4℃冷藏保存待用。

2.2 分組及模型制備

分組：將60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、醋酸地塞米松組、人參石菖蒲高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。

模型制備：模型及給藥組大鼠每天在自制的煙熏倉(cāng)內(nèi)接受煙熏,每日2次,每次30min，煙熏2周后開(kāi)始隔日腹腔注射10%卵清蛋白溶液1 mL3次，將大鼠置于自制的霧化箱給予5%卵清蛋白溶液霧化激發(fā)，每天1次，每次30 min，共激發(fā)3周，激發(fā)過(guò)程中繼續(xù)煙熏，整個(gè)過(guò)程共持續(xù)6周[12]，空白對(duì)照組致敏時(shí)采用相同劑量生理鹽水腹腔注射，激發(fā)時(shí)則采用相同劑量蒸餾水霧化激發(fā)。

2.3 給藥

造模4周后開(kāi)始灌胃給藥，給藥量為醋酸地塞米松（1mg/kg），人參石菖蒲高劑量組（16g/kg）、中劑量組（8g/kg）、低劑量組（4g/kg），空白組、模型組給予等量蒸餾水。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 大鼠引喘潛伏期:末次灌胃給藥30min后，在霧化開(kāi)始后，同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄大鼠出現(xiàn)明顯喘息表現(xiàn)的時(shí)間，即為引喘潛伏期[13]。

2.4.2 樣本采集：將大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，取全血1 mL加入含有EDTA的抗凝管中待用，剩余血液4℃環(huán)境下3000r/min離心15min，分離血清，-20℃保存待用。去除頸部皮毛，鈍性分離氣管，剪開(kāi)氣管，注射器緩慢注入PBS緩沖液1ml，靜置10s后，將緩沖液回抽，重復(fù)操作6次，以3500 r/min離心10 min，取上清液分裝凍存于-20℃冰箱待用。

2.4.3 血液白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的檢測(cè)：全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀分析全血中各細(xì)胞的數(shù)量。

2.4.4 大鼠血清IL-4、IL-6、IFN-γ測(cè)定：試劑盒檢測(cè)血清中IL-4、IL-6、IFN-γ含量。

2.4.5 大鼠肺泡灌洗液IgE、IFN-γ測(cè)定：試劑盒說(shuō)明檢測(cè)肺泡灌洗液中IgE、IFN-γ含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義即具有明顯差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 人參石菖蒲提取物對(duì)咳嗽變異性哮喘大鼠引喘潛伏期的影響

與空白組比較，模型組大鼠引喘潛伏期明顯降低（P＜0.01），與模型組相比，各給藥組大鼠引喘潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 人參石菖蒲提取物對(duì)咳嗽變異性哮喘大鼠WBC、EOS、NEU的影響

與空白組相比，模型組大鼠血液WBC、EOS、NEU明顯升高（P＜0.01），與模型組相比，醋酸地塞米松組、人參石菖蒲提取物高、中劑量組WBC、EOS、NEU明顯降低（P＜0.01），人參石菖蒲提取物低劑量組WBC、EOS、NEU顯著下降（P＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 人參石菖蒲提取物對(duì)咳嗽變異性哮喘大鼠WBC、EOS、NEU的影響（n=10，±s）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量 WBC/（109/L）EOS/（109/L） NEU%空白組 - 7.51±0.56 0.56±0.21 35.7±3.22模型組 - 12.33±1.94## 1.52±0.41## 69.6±3.71##醋酸地塞米松組 1mg/kg 8.52±1.55**0.79±0.33**50.2±1.96**人參石菖蒲提取物高劑量組 16g/kg 8.83±1.72**0.85±0.32**51.5±2.41**人參石菖蒲提取物中劑量組 8g/kg 9.16±1.38**0.93±0.25**57.8±3.11**人參石菖蒲提取物低劑量組 4g/kg 10.09±1.51*1.09±0.39*60.8±4.57*

3.3 人參石菖蒲提取物對(duì)咳嗽變異性哮喘大鼠血清IL-4、IL-6、IFN-γ含量的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清中IL-4、IL-6含量明顯升高（P＜0.01）IFN-γ含量出現(xiàn)明顯降低（P＜0.01），經(jīng)給藥后與模型組相比，各給藥組大鼠血清IL-4、IL-6（P＜0.01）含量明顯降低（P＜0.01），IFN-γ含量明顯升高（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 人參石菖蒲提取物對(duì)大鼠血清IL-4、IL-6、IFNγ含量的影響（n=10，x±s）

3.4 人參石菖蒲提取物對(duì)大鼠肺泡灌洗液IgE、IFNγ含量的影響

與空白組相比，模型組大鼠肺泡灌洗液中IgE含量明顯升高，IFN-γ含量明顯降低（P＜0.01）經(jīng)給藥后與模型組相比，各給藥組大鼠肺泡灌洗液IgE含量明顯降低（P＜0.01），IFN-γ含量明顯升高（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 人參石菖蒲提取物對(duì)大鼠肺泡灌洗液IgE、IFN-γ含量的影響（n=10，x±s）

4 討論

據(jù)報(bào)道，咳嗽變異性哮喘在臨床當(dāng)中多數(shù)表現(xiàn)為咳嗽，而現(xiàn)階段臨床中多種肺部的疾病同樣以咳嗽為主要特征，這就意味著在診治咳嗽變異性哮喘與其他肺部疾病時(shí)會(huì)面臨著較大的困難。在兒童時(shí)期如不接受恰當(dāng)?shù)闹委熆人宰儺愋韵瓨O易發(fā)展成哮喘，這就意味著在兒童時(shí)期接受正確的治療對(duì)于阻止咳嗽變異性哮喘進(jìn)一步發(fā)展具有十分重要的意義[14]。由于兒童對(duì)于西藥的接受能力有限，具有更加溫和療效的中藥逐漸受到重視。鑒于該疾病的藥理學(xué)研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)提供了中藥防治咳嗽變異性哮喘新方向。

在探討中藥治療的療效及作用機(jī)制中，動(dòng)物模型的選擇至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)采用卵清蛋白結(jié)合煙熏法復(fù)制模型[15-17]，方法可行性強(qiáng)。對(duì)于咳嗽變異性哮喘，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷多集中在血常規(guī)、影像學(xué)檢查、氣道炎癥等方面[18]。據(jù)報(bào)道人參、石菖蒲在炎癥方面均具有一定的療效[19-20]。故本實(shí)驗(yàn)采用卵清蛋白結(jié)合煙熏復(fù)制咳嗽變異性哮喘模型大鼠，通過(guò)觀察大鼠引喘潛伏期、全血中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量、血清中IL-4、IL-6、IFN-γ含量和肺泡灌洗液中IgE、IFN-γ含量變化，研究人參石菖蒲醇提物對(duì)于咳嗽變異性哮喘的治療作用。

大鼠引喘潛伏期變化反映了咳嗽變異性哮喘主要特征咳嗽的嚴(yán)重程度，大鼠引喘潛伏期越長(zhǎng)，證明大鼠咳嗽癥狀越輕，癥狀得到顯著改善。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，人參石菖蒲醇提物可以顯著提高大鼠的引喘潛伏期，減輕咳嗽癥狀。全血中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的變化，體現(xiàn)免疫功能的作用，IL-4、IL-6作為白介素家族的兩種標(biāo)志性白介素，反映咳嗽變異性哮喘大鼠的炎癥水平，而IFN-γ具有抗病毒，抗腫瘤和免疫調(diào)控的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參石菖蒲提取物高、中劑量組大鼠血清中WBC、EOS、NEU、IL-4、IL-6含量顯著降低、IFN-γ含量顯著升高、肺泡灌洗液中IgE含量顯著降低、IFN-γ含量顯著升高。表明人參石菖蒲提取物可以有效降低咳嗽變異性哮喘大鼠肺部及體內(nèi)的炎癥水平，緩解卵清蛋白結(jié)合煙熏所致的大鼠咳嗽變異性哮喘。