田淋淋，高 嵩，劉 欣，李 雙，張 斌，宋艷朋，徐 建

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春130103；2.修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，通化134000）

清肺抑火片處方由黃芩、梔子、黃柏、桔梗、大黃、知母、前胡、苦參、天花粉九味組成，具有清肺止嗽，降火生津的功效。用于治療肺熱咳嗽，痰延壅盛，口鼻生瘡，牙根出血，牙齒疼痛，咽喉腫痛，小便赤黃，大便干燥等癥狀。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二冊（WS3-B-0418-90）?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)較低，僅有片劑檢查項(xiàng)，無法全面控制產(chǎn)品質(zhì)量，故本文采用顯微鑒別法、薄層色譜（TLC）法對處方中的大黃、桔梗、黃柏、苦參進(jìn)行定性鑒別研究，采用高效液相色譜（HPLC）法對方中梔子中主要成分梔子苷進(jìn)行含量測定研究，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，完善和提高了清肺抑火片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證產(chǎn)品療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設(shè)備

戴安U3000高效液相色譜儀；MS205DU型電子天平（梅特勒-托利多公司）；SB25-12DT型超聲波清洗器（有限公司）；薄層色譜攝影儀SLD-1（天津思利達(dá)色譜技術(shù)開發(fā)公司）；電子顯微鏡。

1.2 材料與試劑

清肺抑火片（批號：181101、181102、181103），均由修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供；梔子苷對照品（批號：110749-201919）、黃柏對照藥材（批號：121510-201606）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201814）、苦參對照藥材（批號：121019-201708）、苦參堿對照品（批號：110805-201709）；甲醇、正丁醇、甲苯、乙酸乙酯、冰醋酸、氨水、丙酮、三氯甲烷等均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃、桔梗顯微鑒別

取本品，置顯微鏡下觀察：草酸鈣簇晶大，直徑60～140μm（大黃）。聯(lián)結(jié)乳管直徑14～25μm，含淡黃色顆粒狀物（桔梗）。詳見圖1、圖2。

圖1 大黃顯微鑒別圖

圖2 桔梗顯微鑒別圖

2.2 黃柏的薄層鑒別

取本品適量，置研缽中研細(xì)，稱取1.0g置100ml錐形瓶中，加入三氯甲烷20ml、濃氨試液1ml，超聲處理15min，濾過，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)尤燃淄?ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材1.0g，加甲醇20ml，超聲處理15min，濾過，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。取按處方比例及制法制備的黃柏陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液各2μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性無干擾。詳見圖3。

圖3 黃柏薄層色譜圖

2.3 苦參的薄層鑒別

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，作為供試品溶液。取苦參對照藥材1.0g，同法制成對照藥材溶液。另取按處方比例及制法制備的苦參陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。再取苦參堿對照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液各2μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-濃氨試液（2∶4∶3∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性無干擾。詳見圖4。

圖4 苦參薄層色譜圖

2.4 梔子苷的含量測定

2.4.1 檢測波長的選擇

取梔子苷對照品適量，用甲醇溶解，采用DAD檢測器，于200～400nm波長下檢視光譜圖。梔子苷在240nm波長處出現(xiàn)最大吸收。故選擇240nm作為梔子苷的檢測波長。詳見圖5。

圖5 梔子苷的紫外吸收圖

2.4.2 色譜條件

色譜柱：welch Ulitmate C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）；檢測波長為240nm。理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

2.4.3 溶液的制備

2.4.3.1 對照品溶液的制備

取梔子苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每lml含60μg的溶液，即得。

2.4.3.2 供試品溶液的制備

取本品20片，置研缽中研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，稱定重量，超聲處理30min，取出，放冷，再次稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.3.3 梔子陰性樣品溶液的制備

取按處方比例梔子的陰性對照樣品，按“2.4.3.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.4.4 測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定。

2.4.5 線性關(guān)系考察

取梔子苷對照品溶液，濃度分別為0.0154、0.0308、0.0617、0.123、0.3083mg/ml。精密吸取上述對照品溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.0044X+0.0017，r=0.9999。表明梔子苷在0.154～3.083μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.6 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取“2.4.3”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μl，注入液相色譜儀，依法測定。結(jié)果陰性對照樣品的色譜圖中，在與梔子苷對照品吸收峰保留時(shí)間的相應(yīng)位置上，無吸收峰出現(xiàn)，表明陰性對照無干擾，此方法專屬性強(qiáng)。詳見圖6。

圖6 梔子苷含量測定HPLC色譜圖

2.4.7 精密度試驗(yàn)

取梔子苷對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μl，結(jié)果梔子苷峰面積RSD=0.20%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24h按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄梔子苷峰面積，結(jié)果RSD=1.01%，表明供試品溶液在24min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號：181101）適量，置研缽中研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，共6份，按“2.4.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件測定梔子苷含量。結(jié)果梔子苷的平均含量為4.0049mg/g，RSD=0.39%（n=6），表明此方法重復(fù)性良好。

2.4.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的清肺抑火片（批號：181101，含量：4.0049mg/g），取約0.25g，精密稱定，共6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入梔子苷對照品溶液（梔子苷對照品用50%甲醇制成濃度為0.0214mg/ml的溶液）50ml，“2.4.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為99.8%，RSD=0.43%（n=6），表明此方法準(zhǔn)確可行。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.11 樣品含量測定

依法對3批清肺抑火片（批號：181101、181102、181103）進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表2.。

表2 3批樣品含量測定結(jié)果

3 討論

清肺抑火片現(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)較低，為能更全面的控制產(chǎn)品質(zhì)量，我們進(jìn)行了較系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，方中大黃和桔梗為粉末入藥，故建立了顯微鑒別項(xiàng)。建立的黃柏、苦參薄層鑒別方法，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)。梔子是方中主要藥味，梔子苷是其主要藥效成分，故增加梔子苷含量鑒別項(xiàng)，方法簡單易操作、專屬性強(qiáng)，分離度高，重現(xiàn)性好，可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。