趙永魁，王曉濤，陳建立，王長(zhǎng)友，張國(guó)志

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是一種常見的甲狀腺惡性腫瘤，其分化程度高、預(yù)后較好。然而，部分患者易早期發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是其復(fù)發(fā)和死亡的主要原因[1,2]。臨床上，對(duì)于PTC的治療首選手術(shù)切除并輔以術(shù)后131I治療，但常發(fā)生肝腎功能損傷等不良反應(yīng)[3]。PPARγ配體激動(dòng)劑羅格列酮(ROZ)是治療2型糖尿病的一線口服藥物，具有腎臟保護(hù)作用。隨著腫瘤治療研究的不斷深入，許多證據(jù)表明ROZ對(duì)多種癌癥具有抑制作用，可降低患者的發(fā)病率和病死率，但具體作用機(jī)制尚不明確[4,5]。2017年10月～2018年5月，我們觀察了ROZ對(duì)人PTC細(xì)胞BCPAP增殖、凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制，以期為ROZ輔助治療PTC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 BCPAP細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù))，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶(美國(guó)Gibco公司)；AnnexinV-FITC/PI染料試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Sigma公司)；線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)、第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、β-actin抗體(美國(guó)CST公司)，HR標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、DAB顯影液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；ROZ、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；PTEN特異性抑制劑bpV(phen)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀、濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)(上海Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。其余材料及儀器由華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將BCPAP細(xì)胞接種于含10% FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件的孵育箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BCPAP細(xì)胞，按1×104/孔接種96孔板。將細(xì)胞分別置于ROZ終濃度為0、20、40 μmol/L的完全培養(yǎng)基中，各濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔；分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，各孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，于培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h；棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100 μL，繼續(xù)于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)15 min。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定各孔光密度值(OD值)，OD值越大增殖能力越強(qiáng)。

1.2.3 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BCPAP細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，以2×106/孔接種于6孔板并分為4組。A組不處理，B組加入終濃度為40 μmol/L的ROZ處理，C組加入終濃度為1 μmol/mL PTEN特異性抑制劑bpV(phen)處理，D組先加入終濃度為1 μmol/mL bpV(phen)處理12 h后再加入終濃度為40 μmol/L的ROZ處理。各組處理48 h后，將細(xì)胞制備成懸液放入1.5 mL離心管中，冰PBS洗滌細(xì)胞2次；加入500 μL Binding Buffer，混勻后避光；各離心管內(nèi)分別加入5 μL Annexin V-FITC，和5 μL Pronpidium Iodide，避光孵育15 min。1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，以右上象限和右下象限凋亡率之和視為細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白及PTEN/AKT通路蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BCPAP細(xì)胞，按1.2.3進(jìn)行分組處理。各組處理48 h后以RIPA裂解液裂解，離心收集蛋白。BCA法定量總蛋白，SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜(90 V，90 min)，10%脫脂奶封閉；一抗孵育過夜(1∶1 000) ，二抗(1∶1 000)37 ℃恒溫箱孵育2 h；上機(jī)熒光顯色，Image J軟件分析灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 ROZ對(duì)BCPAP細(xì)胞增殖能力的影響 隨著ROZ濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，BCPAP細(xì)胞增殖的OD值逐漸降低(P均<0.01)。見表1。

表1 ROZ對(duì)BCPAP細(xì)胞增殖能力的影響

注：與上一濃度或前一作用時(shí)間比較，*P<0.01。

2.2 ROZ對(duì)BCPAP細(xì)胞凋亡的影響 A、B、C、D組細(xì)胞凋亡率分別為7.252%±0.103%、15.076%±0.288%、7.556%±0.448%、7.764%±0.241%，B組細(xì)胞凋亡率高于A、C、D組(P均<0.01)，A、C、D組間細(xì)胞凋亡率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率比較(AnnexinV-FITC/PI染色)

2.3 ROZ對(duì)BCPAP細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白、PTEN/AKT通路蛋白表達(dá)的影響 與A、C、D組比較，B組細(xì)胞Bax、PTEN蛋白表達(dá)增加，而Bcl-2、p-AKT蛋白表達(dá)減少(P均<0.01)，A、C、D組間細(xì)胞Bcl-2、Bax、PTEN、p-AKT、AKT表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2和圖2、3。

表2 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、PTEN、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)比較

注：與B組比較，*P<0.01。

圖2 各組細(xì)胞Bcl 2、Bax蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

圖3 各組細(xì)胞PTEN、p-AKT和AKT蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

3 討論

甲狀腺癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率增長(zhǎng)迅速?？傮w而言，大多數(shù)甲狀腺腫瘤起源于甲狀腺濾泡細(xì)胞或?yàn)V泡旁細(xì)胞[6]。在甲狀腺癌的多種病理類型中，PTC是臨床上常見的分化類型，占所有甲狀腺惡性腫瘤的86%[7]。腫瘤根治術(shù)是目前治療甲狀腺癌的首選方式[8]，且絕大多數(shù)患者術(shù)后輔以同步131I放療后有著很好的總體生存率和治療結(jié)局，但肝腎功能損傷等不良反應(yīng)是導(dǎo)致131I治療終止的常見原因之一[9,10]。

無限增殖和抗凋亡能力會(huì)加速腫瘤的惡化與不良結(jié)局，也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因[11]。因此，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是目前化療藥物或協(xié)同化療藥物的常見靶點(diǎn)。Bcl-2和Bax蛋白是Bcl家族中一對(duì)重要的正負(fù)調(diào)控因子，在細(xì)胞程序性凋亡的多條途徑中起著至關(guān)重要的作用[12]。Bcl-2和Bax是線粒體凋亡途徑上的一對(duì)關(guān)鍵拮抗基因，Bcl-2/Bax相對(duì)表達(dá)比例的改變可以直接導(dǎo)致包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等在內(nèi)的細(xì)胞器和關(guān)鍵蛋白發(fā)生改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13,14]。同時(shí)，作為上游調(diào)控蛋白，Bcl-2也可以通過抑制Caspase蛋白家族的活化，阻止細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)控細(xì)胞的凋亡進(jìn)程[15]。

PTEN是一種具有雙重特異性磷酸酶的抑癌基因，它具有多種生物活性，并作用于多條信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、黏附和血管生成，已被證實(shí)是抑制腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因[16, 17]。PTEN可以通過負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，減弱來自于上游信號(hào)傳導(dǎo)通路的信號(hào)強(qiáng)度，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖的作用[18]。研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制可以下調(diào)Bcl-2/Bax表達(dá)比例，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。在惡性黑色素瘤細(xì)胞模型中特異性上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，已被證實(shí)可以通過這一途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[19]。

在治療糖尿病的應(yīng)用過程中，PPARγ配體激動(dòng)劑顯示了較好的腎臟保護(hù)作用[20]。此外，近年來的研究表明，PPARγ被其特異性配體激活后，能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制其增殖[21,22]。在我們的前期研究中，也初步證實(shí)了PPARγ配體激動(dòng)劑ROZ可以通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡來調(diào)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，但具體機(jī)制尚未完全闡明[23]。本研究中，我們首先利用MTT法證實(shí)了ROZ對(duì)PTC細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。通過流式細(xì)胞儀和Western blotting法驗(yàn)證了ROZ對(duì)PTC細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過改變Bcl-2/Bax相對(duì)表達(dá)比例，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。bpV(phen)是PTEN選擇性抑制劑[24]，在分別采用ROZ和bpV(phen)處理PTC細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，ROZ可以上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制AKT信號(hào)通路的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡；同時(shí)，bpV(phen)可以逆轉(zhuǎn)這種變化。這說明ROZ可能是通過PTEN/AKT通路來抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)然，PPARγ配體激動(dòng)劑的調(diào)節(jié)涉及很多方面，本研究只是其中一個(gè)方面。除了抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡以外，還可能涉及其他相關(guān)信號(hào)通路及分子靶點(diǎn)，PTEN/AKT通路可能并不是PPARγ配體激動(dòng)劑抑制腫瘤細(xì)胞的惟一信號(hào)通路，具體機(jī)制尚需進(jìn)行后續(xù)研究。