張 婷，廖 航，程玉婷，吳小紅*

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，重慶401147；2口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401147；3重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401147）

慢性牙周炎是最常見的口腔疾病之一，其導(dǎo)致的持續(xù)牙槽骨丟失將引起牙齒松動［1］。鹽酸米諾環(huán)素（minocycline hydrochloride ，MH）是一種廣譜的四環(huán)素類抗生素，用于對抗引起周期性炎癥的大多數(shù)細(xì)菌［2］。除了抗菌活性外，鹽酸米諾環(huán)素已被證明可以抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成［3］。研究表明這種抗生素質(zhì)量濃度為1 mg/mL，即血漿中的標(biāo)準(zhǔn)治療濃度，顯著增加了人類骨髓成骨細(xì)胞的增殖［4］。但是，Almazin 等［5］發(fā)現(xiàn)牙周袋中高濃度的抗生素可能直接或間接影響支持性牙周組織的活細(xì)胞，尤其是骨形成的成骨細(xì)胞。此外，高水平的鹽酸米諾環(huán)素會對細(xì)胞產(chǎn)生劑量依賴性的毒性作用，抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化［4］。前期課題組也研究表明一定濃度的米諾環(huán)素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而隨著濃度的增加這種促增殖作用開始下降［6］。因此，為了避免局部高濃度的抗生素，亞抗菌劑量的鹽酸米諾環(huán)素及其局部釋放的有效性成為最近研究的焦點(diǎn)［7］。前期本課題組制備鹽酸米諾環(huán)素PLGA 纖維膜改善米諾環(huán)素突釋，從而使其在抑菌的同時(shí)能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，但它第1 天的釋放仍約為20%［8］。

蔗糖醋酸鹽異丁酸酯（sucrose acetate isobutyrate，SAIB）貯庫是一種很有前景的注射型緩釋系統(tǒng)［9］，具有生物降解性和生物相容性［10］，并且加入少量的溶劑（如乙醇），便可以顯著降低SAIB 的黏度。當(dāng)貯庫被輸送到體內(nèi)時(shí)，隨著溶劑從貯庫擴(kuò)散到周圍組織，從而緩慢釋放藥物，它就從液態(tài)變成了半固態(tài)。但是當(dāng)溶解在溶劑中的藥物濃度過高時(shí)，也可能出現(xiàn)初始的突釋［11］。Lin等［12］將PLGA微球與SAIB 貯庫相結(jié)合可將利培酮在第1 天的釋放降低到0.64%，前期本研究將PCL 微球與SAIB貯庫結(jié)合可將柚皮苷在第1 天的釋放降低到6.3%［13］。微球作為最常用的藥物遞送系統(tǒng)之一，制備它的方法有很多，其中靜電噴霧具有許多優(yōu)點(diǎn)，如改善均勻性或單分散性、減少團(tuán)聚、高封裝效率和制備簡單［14-15］。PLGA是一種可生物降解的聚合物，應(yīng)用廣泛，具有良好的生物相容性和生物降解性，并且它有可能精確控制藥物釋放數(shù)天到數(shù)月的動力學(xué)過程［16-18］。因此，本研究旨在制備負(fù)載鹽酸米諾環(huán)素的PLGA 電噴微球，并分析其形態(tài)、表面潤濕性、藥物釋放及其降解等性質(zhì)，并將微球與SAIB結(jié)合，以期獲得更好的緩釋作用。

1 材 料

1.1 原料與試劑

聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA，n（LA）∶n（GA）=75∶25，濟(jì)南岱港生物材料有限公司；相對分子質(zhì)量80 kD］；鹽酸米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品、蔗糖醋酸鹽異丁酸酯（SAIB，相對分子質(zhì)量846.91，1.146 g/mL）（美國Sigma 公司）。其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

靜電紡絲儀（北京永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司）；掃描電子顯微鏡（日本Jeol公司）；偏光顯微鏡（日本Nikon 公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；接觸角測量儀（北京環(huán)球恒達(dá)科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司；圖像分析軟件ImageJ（美國國立衛(wèi)生研究院）。

2 方 法

2.1 鹽酸米諾環(huán)素微球的制備

將PLGA 溶于氯仿，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的PLGA 溶液，然后將鹽酸米諾環(huán)素（相對于PLGA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%，2%）加入PLGA 溶液中，用磁力攪拌器恒溫?cái)嚢? h 充分混合。在室溫下，將所配置的溶液分別裝入21 號不銹鋼鈍性針頭的5 mL 注射器，針頭與高壓直流電源的正極相連，與針頭相距20 cm 的接收滾筒上接負(fù)極，滾筒上蓋著鋁箔紙，作為微球的接收器，制備得到空白微球（M）以及鹽酸米諾環(huán)素微球（minocycline hydrochloride microsphere，MH-M）。制備微球的電噴參數(shù)如下：8%PLGA溶液在14 kV的高壓電場中，以0.25 mL/h的推注速度，相對濕度控制在31%～33%，溫度控制在21～23 ℃。鋁箔紙上覆蓋載玻片收集微球，然后置于倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)。電噴結(jié)束后，鋁箔紙置于恒溫箱中干燥48 h，揮發(fā)殘留的有機(jī)溶劑，收集到的微球轉(zhuǎn)移至小玻璃瓶于-20 ℃保存。

2.2 鹽酸米諾環(huán)素微球的特征

2.2.1 鹽酸米諾環(huán)素微球的大小與形態(tài) 收集到微球的鋁箔紙剪成1 cm×1 cm，固定在樣品臺上，旋轉(zhuǎn)蒸鍍儀噴金，使用掃描電鏡（SEM）進(jìn)行觀察；載玻片收集到的微球在偏振光顯微鏡下觀察，用ImageJ 軟件測量微球直徑并計(jì)數(shù)（每個(gè)樣本超過100 個(gè)），結(jié)果以表示；微球直徑的單分散性即粒徑分布一致性，用變異系數(shù)CV（%），CV 越低表明微球單分散性即粒徑分布一致性越佳。

2.2.2 接觸角測試 用鋁箔紙收集到的微球直接進(jìn)行接觸角儀器檢測，每組3 個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)測量3次，結(jié)果以xˉ±s表示。

2.2.3 鹽酸米諾環(huán)素微球的載藥量以及包封率針對包封率測定，用超速離心法測定微球表面游離MH 的含量。稱取微球5 mg，精確到0.1 mg，溶于PBS 溶液1 mL 中，混勻形成樣品溶液，轉(zhuǎn)移到1.5 mL 超速離心管中，然后在13 000 r/min 離心10 min。提取上清液，利用酶標(biāo)儀在350 nm 波長處分析。重復(fù)3次，計(jì)算包封率。

針對載藥量的測定，通過將微球5 mg 溶解在無水乙醇1 mL 中，超聲處理10 min 后直至樣品中聚合物完全溶解，然后在15 000 r/min離心20 min。最后提取上清液并利用酶標(biāo)儀在350 nm 波長處分析，從而來測定球體中的MH 含量。重復(fù)3 次，計(jì)算載藥量。

2.2.4 鹽酸米諾環(huán)素微球的藥物分配 鹽酸米諾環(huán)素屬于第二代半合成的四環(huán)素族藥物，具有在一定條件下能夠被激發(fā)出綠色熒光的特性。因此，將電噴微球樣品置于玻片上，在激光掃描共聚焦顯微鏡下，使用375 nm的激發(fā)波長進(jìn)行觀察。

2.3 鹽酸米諾環(huán)素/SAIB以及鹽酸米諾環(huán)素微球/SAIB的制備

將SAIB 與EtOH 混合得到透明的SAIB-EtOH溶液（SAIB 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%）。使用前，將鹽酸米諾環(huán)素0.1 mg 分散在上述SAIB-EtOH 系統(tǒng)中以產(chǎn)生鹽酸米諾環(huán)素/SAIB（MH-SAIB）貯庫。類似地，將鹽酸米諾環(huán)素微球5 mg在SAIB-EtOH溶液50 mg中旋轉(zhuǎn)5 min均勻混合，以獲得鹽酸米諾環(huán)素微球/SAIB（MH-M-SAIB）混合貯庫（約含鹽酸米諾環(huán)素0.1 mg）。

2.4 體外釋放

取鹽酸米諾環(huán)素微球5 mg（約含鹽酸米諾環(huán)素0.1 mg）以及MH-M-SAIB（約含鹽酸米諾環(huán)素0.1 mg）50 mg 分別 加入 含 有PBS 溶 液1 mL 的1.5 mL EP 管（pH 7.4，0.02% NaN3）。所有的樣本置于搖床中恒溫37 ℃水浴。于定點(diǎn)時(shí)間取樣，將各樣本溶液進(jìn)行13 000 r/min離心10 min后取上清液，采用酶標(biāo)儀測量藥物吸收度。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 體外降解

體外降解率是通過測定微球在PBS 中浸泡過程中的失重進(jìn)行測定［8］。因此，分別將空白微球以及鹽酸米諾環(huán)素微球5 mg 浸泡在PBS 1.5 mL中，并在37 ℃恒溫箱中保存60 d。在特定的時(shí)間間隔內(nèi)測定PBS 溶液pH，并與新鮮PBS 交換溶液，以確保pH 恒定為7.4。每個(gè)降解期后（7，15，30，45，60 d），樣品用去離子水洗滌，在冷凍干燥箱中干燥2 d，電子天平秤重，計(jì)算降解實(shí)驗(yàn)后的體外降解率。降解率（%）=（W0-Wt）/W0× 100。其中，W0和Wt分別是降解期前后電噴微球的干燥重量。每個(gè)樣本組至少重復(fù)3次。

2.6 孔隙率

將SAIB 溶液注入水相，外水迅速擴(kuò)散到貯庫中，而溶劑則從基質(zhì)中擴(kuò)散到水相中。這導(dǎo)致富水區(qū)域的多孔網(wǎng)絡(luò)的形成，周圍是一個(gè)富含SAIB的系統(tǒng)?？紫堵适峭ㄟ^測試擴(kuò)散到貯庫的液體的體積來確定的。將約分析樣品50 mg 注入PBS 1.5 mL 中，并置于37 ℃恒溫箱中。在特定時(shí)間（2，8，15，30，45 d）取PBS。然后，貯庫被凍干以除去吸收的液體。通過測量凍干前后的水位差，可以方便地確定貯庫吸收的液體量。因此，孔隙率可用公式（1）計(jì)算：

式中：p為孔隙率，W1為SAIB 溶液的質(zhì)量，W2為吸收液體后貯庫的質(zhì)量，W3為貯庫凍干后的質(zhì)量，c為SAIB溶液中SAIB的濃度，ρ1為液體的密度，ρ2為SAIB的密度。每種溶液的試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以表示。單因素方差分析（ANOVA）和SNK-q 測驗(yàn)用來確定統(tǒng)計(jì)顯著性。所有計(jì)算均使用SPSS軟件20.0版進(jìn)行，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 鹽酸米諾環(huán)素微球的特征

圖1-A 及圖1-B 分別是微球的光學(xué)及電子顯微鏡圖。由圖可見微球大多數(shù)呈球形，較均勻，且表面相對光滑。同時(shí)，用ImageJ 測得微球直徑為（5.294 ± 1.222）μm，變異系數(shù)CV 為11.22%，微球的尺寸分布較窄，分布圖如圖1-D所示。

接觸角測試是材料親水性能表征的重要指標(biāo)之一，經(jīng)測量微球接觸角為（95.98 ± 0.67）°（圖1-C），表明該材料表面較疏水，并且微球的載藥量和包封率分別為（1.689 ± 0.005）%和（69.57 ± 0.23）%，有研究表明親水性藥物與具有末端親水基團(tuán)的PLGA 結(jié)合所制得的載藥微球具有較高的包封率［19］，因此有望通過增加該材料的親水性來增加鹽酸米諾環(huán)素的包封率。激光共聚焦顯微圖像見鹽酸米諾環(huán)素均勻分布于微球內(nèi)（圖2）。

3.2 鹽酸米諾環(huán)素微球及微球貯庫的體外釋放

鹽酸米諾環(huán)素微球的體外釋放曲線如圖3-A所示。微球第1 天的藥物釋放達(dá)60%，前3 天釋放接近66%，隨后每天以約2.7%的釋放速率持續(xù)至第7天。

MH-M-SAIB 和MH-SAIB 貯庫在PBS 培養(yǎng)基中的體外藥物釋放曲線如圖3-B 所示。由圖可知，將鹽酸米諾環(huán)素微球裝入SAIB 貯庫后，第1 天藥物釋放率從61.24%下降到3.27%，然而MH-SAIB 貯庫仍然顯示出明顯的突釋（高達(dá)24.79%）。在最初的7 d里，MH-M-SAIB以及MH-SAIB都顯示出高濃度藥物釋放率，累計(jì)釋放18.15%和56.16%，前7 天的平均釋放率分別約為2.59%和8.02%（圖3-B）。7 d 后，藥物從MH-M-SAIB 以及MH-SAIB 貯庫中以約每天1.03%的釋放速率持續(xù)釋放，直至第42 天，總共釋放55.29%以及91.09%。體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用常用的4 種釋放動力學(xué)模型擬合，即零級（方程式：Q= a + Kt）、一級（方程式：ln（1-Q）=a+Kt）、Higuchi（方程：Q=a+Kt1/2）和Ritger Peppas（方程：Q=Ktn）模型［20-22］，研究了基于SAIB 貯庫的MH 藥物釋放動力學(xué)，得到的模型方程以及參數(shù)見表1。在所有模型中，Ritger-Peppas模型具有較好的一致性，因此用于擬合MH-MSAIB 以及MH-SAIB 的溶出曲線，以評估MH 的藥物釋放，良好的擬合反映在表2 中。SAIB 貯庫MH釋放曲線的線性擬合表明存在兩個(gè)釋放階段（表2），斜率代表藥物釋放速率，從第1 天到第7 天，MH-SAIB 的藥物釋放速率大于MH-M-SAIB 貯庫，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而第7 天后，MH-MSAIB 的藥物釋放速率稍大于SAIB 貯庫，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

Figure 3 Release curves of MH-M(A)and sucrose acetate isobutyrate（SAIB）-based depot MH-SAIB and MH-M-SAIB(B)(xˉ± s,n = 3)

Table 1 Parameters obtained by fitting four different models to the release data for SAIB-based depot drug release kinetics

Table 2 Evaluation of drug release kinetics of SAIB-based depot according to the Ritger-Peppas equation

局部應(yīng)用抗生素治療牙周炎的成功主要依賴于抗菌藥物的持續(xù)釋放［23］，并且鹽酸米諾環(huán)素在適宜濃度內(nèi)能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而高濃度反而會抑制成骨細(xì)胞的增殖。鹽酸米諾環(huán)素對密螺旋體的最小抑制濃度小于0.125 μg/mL［24］，對放線桿菌的最小抑制濃度為0.25 μg/mL［25］，同時(shí)，Almazin 等［5］發(fā)現(xiàn)鹽酸米諾環(huán)素質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，對成骨細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素質(zhì)量濃度為10 μg/mL 時(shí)，對成骨細(xì)胞的增殖作用開始下降［6］?？傊?，一個(gè)有效的藥物傳遞系統(tǒng)通常是將一種治療物質(zhì)引入體內(nèi)，通過控制藥物在體內(nèi)釋放的速率、時(shí)間和位置來提高其有效性和安全性，并避免不良反應(yīng)［26］。因此，本實(shí)驗(yàn)將鹽酸米諾環(huán)素第1天的釋放率降低到了3.7%，以后以約1.03%的釋放速率緩慢持續(xù)至42 d，不僅能達(dá)到鹽酸米諾環(huán)素的有效抑菌濃度，而且該濃度也未對成骨細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，可做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其成骨及抑菌效果。

3.3 空白微球以及鹽酸米諾環(huán)素微球的降解

已知PLGA降解遵循偽一級動力學(xué)［27］。由表3可知，降解曲線的方程擬合表明鹽酸米諾環(huán)素微球存在3 個(gè)降解階段，空白微球存在2 個(gè)降解階段，鹽酸米諾環(huán)素微球和空白微球的降解與偽一級方程擬合都得到了較好的一致性。由圖4可知，鹽酸米諾環(huán)素微球降解速率由大到小依次為45～60 d、0～7 d、7～45 d，空白微球的降解速率由大到小依次為45～60 d、0～45 d。這主要是因?yàn)?，PLGA 體外降解是通過酯鍵的水解進(jìn)行，然而分子鏈上酯鍵的水解斷裂是無規(guī)則的，每個(gè)酯鍵都可能被水解，被水解的部位越多，相對分子質(zhì)量降低也就越快，然而PLGA 相對分子質(zhì)量只有降低到某一臨界值，才能溶解于水。因此在降解前期，微球表層分子鏈無規(guī)斷裂，形成極少量能溶于水的小分子鏈斷，相對分子質(zhì)量顯著降低，而微球無明顯質(zhì)量下降現(xiàn)象，但是隨著降解時(shí)間的延長，大量的小分子鏈斷開始在微球中形成，并擴(kuò)散溶解進(jìn)模擬體液，微球質(zhì)量損失速率加快。所以表現(xiàn)為體外降解前期相對分子質(zhì)量降低幅度較大，后期質(zhì)量損耗幅度大［28-30］。同時(shí)，在0～7 d，鹽酸米諾環(huán)素微球以及空白微球的降解率分別為8.66%和6.66%，鹽酸米諾環(huán)素微球的降解率大于空白微球，鹽酸米諾環(huán)素微球在0～7 d 的藥物釋放率（70.26%，約0.07 mg）表明，在0～7 d 時(shí)藥物大量釋放（由圖3-A 可知）；而在7～45 d 以及45～60 d，鹽酸米諾環(huán)素微球以及空白微球的降解率都分別為21.34%以及18.66%，兩者之間無差異，這表明微球的降解速率與所含藥物與否沒有相關(guān)性。空白微球及鹽酸米諾環(huán)素微球在60 d 內(nèi)降解約50%，表明當(dāng)鹽酸米諾環(huán)素釋放結(jié)束后，該材料仍存于體內(nèi)，因此有望進(jìn)一步研究得到釋放與降解時(shí)間的統(tǒng)一。

Table 3 Evaluation of degradation kinetics of microspheres according to pseudo-first order equation

Figure 4 Degradation image of MH-M and blank microspheres（M）(xˉ± s,n = 3)

3.4 MH-M-SAIB以及MH-SAIB的孔隙率

當(dāng)微球分散在基質(zhì)豐富的相并擴(kuò)散到PBS 緩沖液中時(shí)，貯庫顯示出不同的孔隙率（代表不同的擴(kuò)散速率）。圖5顯示了MH-M-SAIB以及MH-SAIB在PBS 介質(zhì)中的孔隙率變化。從2～45 d，MH-MSAIB 的孔隙率始終高于MH-SAIB，這可能是由于微球本身具有吸水性，從而導(dǎo)致更高的孔隙率。此外，在2～15 d 時(shí)，MH-M-SAIB 的孔隙率增長迅速，15 d 后則相對穩(wěn)定；而MH-SAIB 在2～8 d 時(shí)增長迅速，8～15 d 增長稍慢一些，15 d 后相對穩(wěn)定，這表明釋放行為可能與孔隙率的變化有關(guān)。在15 d 之前觀察到一個(gè)相對陡峭的變化率，這和MH-SAIB 和MH-M-SAIB 的快速藥物釋放有關(guān)，而在15～45 d 之間觀察到緩慢的速率變化，對應(yīng)于穩(wěn)定和長期的釋放。并且MH-M-SAIB的孔隙率一直大于MH-SAIB，但是MH-M-SAIB 的藥物釋放速率卻低于MH-SAIB，這表明在SAIB 貯庫中，藥物釋放速度主要受溶解于SAIB貯庫中的藥物濃度影響。MH-M-SAIB 里的藥物大部分位于微球內(nèi)部以及表面，溶解于SAIB貯庫中的藥物濃度較低，并且藥物從SAIB 釋放出來擴(kuò)散路徑較長；而MH-SAIB所含藥物僅位于SAIB 貯庫內(nèi)部以及表面，溶解于SAIB 貯庫中的藥物濃度較高，并且藥物從SAIB 釋放出來的擴(kuò)散路徑較短，從而導(dǎo)致MH-SAIB 較MH-M-SAIB更快釋放［31］。

Figure 5 Porosity of MH-M-SAIB and MH-SAIB(xˉ± s,n = 3)

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過靜電噴霧的方法，成功制備表面光滑，尺寸分布均勻的鹽酸米諾環(huán)素PLGA 微球，并將其與SAIB混合成功制備鹽酸米諾環(huán)素微球貯庫。同時(shí)，研究結(jié)果表明，鹽酸米諾環(huán)素微球貯庫能顯著降低藥物的突釋，達(dá)到持續(xù)穩(wěn)定的長期釋放，為后續(xù)進(jìn)一步研究鹽酸米諾環(huán)素微球貯庫的成骨效果及抑菌實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。