朱庭沛，桂裕昌，覃慧晴，陳建泉，唐云，許建文

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021）

結(jié)腸癌（colon cancer）是一種常見的消化道惡性腫瘤，據(jù)我國2018 年癌癥統(tǒng)計報告顯示，相較2015 年，結(jié)腸癌的發(fā)病率已由第五位上升至第三位，死亡率仍維持在第五位［1］。我國已成為全球結(jié)腸癌每年新發(fā)病例和死亡病例數(shù)最多的國家。結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年顯著上升，且多數(shù)病人在確診時已屬于中晚期。目前針對結(jié)腸癌的治療手段以外科手術(shù)結(jié)合放化療為主，雖有一定治療成效，但腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的生存率［2］。因此，探尋結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，提高結(jié)腸癌早期診斷率，尋找新的治療靶點迫在眉睫。

微小RNA（miRNA）是一類由19～23 個核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，它通過堿基互補配對方式與靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補位點特異性結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［3］。研究表明，miRNA 在不同條件下是一把雙刃劍，既可以作為癌基因致病，也可以作為抑癌基因?qū)C(jī)體起到保護(hù)作用［4-5］。miRNA 對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的影響，包括維持增殖信號、逃逸生長抑制因子、抵抗細(xì)胞死亡、激活侵襲和轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)血管生成等［6］。近年各項研究發(fā)現(xiàn)，miR-28-5p 在食管癌、乳腺癌、淋巴瘤與膠質(zhì)瘤中均有抑癌作用［7-10］，但有關(guān)miR-28-5p 對結(jié)腸癌生物學(xué)作用的影響尚少見報道。本研究旨在探討miR-28-5p 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，為結(jié)腸癌的臨床防治提供新的研究方向和選擇。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460 以及人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480、SW620 均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，胎牛血清購自依科賽生物科技（太倉）有限公司，RMPI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，lipofectamine 3000 購自美國Invitrogen 公司，miR-28-5p 過表達(dá)與沉默siRNA （miR-28-5p mimic and miR-28-5p inhibitor）由韓國Bioneer 公司合成，CCK 盒購自美國Abmole 公司，NucleoZOL 試劑盒購自德國MACHEREY-NAGEL 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（638313）、實時熒光定量試劑盒（RR820A）及相關(guān)引物均購自日本Takara 公司，其余細(xì)胞培養(yǎng)材料均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國賽默飛世爾科技公司，倒置顯微鏡購自尼康映像儀器銷售（中國）有限公司，NanoDropTMOne 超微量核酸蛋白濃度測定儀購自美國賽默飛世爾科技公司，QuantStudioTM5 全功能定量PCR 儀購自美國Applied Biosystems 公司，酶標(biāo)儀購自德國Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 NCM460、HCT116、SW480、SW620 細(xì)胞均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素混合液的RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將HCT116、SW480、SW620 三種細(xì)胞株各分為三組：對照組、過表達(dá)組、沉默組，其中對照組不予特殊處理，過表達(dá)組、沉默組取對數(shù)生長期細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-28-5p mimic 和miR-28-5p inhibitor，轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)lipofectamine 3000 試劑盒說明書進(jìn)行，并根據(jù)轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化方案。

1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng) 使用NucleoZOL試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，NanoDropTMOne 檢測總RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA（37℃1 h，85℃5 min），PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件依據(jù)試劑盒說明書設(shè)置?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計算。U6 作為內(nèi)參，引物序列詳見表1。

表1 PCR 引物序列

1.2.3 CCK8 法檢測細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液（1×104個細(xì)胞），每組設(shè)置5 個復(fù)孔，置于37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h。隨后去除原有培養(yǎng)基，每孔加入90 μL 完全培養(yǎng)基和10 μL CCK8 試劑（確保無氣泡生成），37℃環(huán)境下孵育1 h 后，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的光密度（OD）值。

1.2.4 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞鋪滿6 孔板底部后，每孔用無菌10 μL 槍頭輕劃三條垂直豎線，用常溫?zé)o菌磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗三次，隨后加入2 mL 完全培養(yǎng)基，分別于0 h、48 h 顯微鏡下拍照，使用ImageJ 軟件分析劃痕面積，計算劃痕遷移率=（0 h 面積-48 h 面積）/0 h 面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-28-5p 在不同結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)差異

培養(yǎng)NCM460、HCT116、SW480 和SW620 細(xì)胞，采用qRT-PCR 檢測miR-28-5p 在各細(xì)胞中的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，miR-28-5p 在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、SW480 和SW620 中的相對表達(dá)量均低于正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-28-5p 在不同細(xì)胞中的相對表達(dá)量

2.2 miR-28-5p 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

將HCT116、SW480 和SW620 三種細(xì)胞各分為三組：對照組、過表達(dá)組、沉默組。對照組不予處理，過表達(dá)組和沉默組分別轉(zhuǎn)染miR-28-5p mimic 和miR-28-5p inhibitor，采用qRT-PCR 檢測miR-28-5p 在各組細(xì)胞中的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-28-5p 在過表達(dá)組中的相對表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在沉默組中的相對表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），證明轉(zhuǎn)染成功。見圖2。

圖2 miR-28-5p 在不同轉(zhuǎn)染后結(jié)腸癌細(xì)胞中的相對表達(dá)量

2.3 miR-28-5p 對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，相較于對照組，HCT116、SW480 和SW620 三種結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），沉默組細(xì)胞的遷移能力均增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 miR-28-5p 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

CCK8 檢測結(jié)果顯示，12 h 時，三種結(jié)腸癌細(xì)胞中各組細(xì)胞間OD 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。24 h、48 h 時，相較于對照組，三種結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)組細(xì)胞的OD 值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明其增殖能力下降；沉默組細(xì)胞的OD 值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明其增殖能力增強。見表3。

表2 各組細(xì)胞劃痕遷移率比較 （,%）

表2 各組細(xì)胞劃痕遷移率比較 （,%）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

表3 各組細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果比較 （）

表3 各組細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果比較 （）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

3 討論

結(jié)腸癌是女性第二大常見癌癥和男性第三大常見癌癥，約占全球每年新確診癌癥總數(shù)的10%。因其發(fā)病較隱匿，早期臨床癥狀常以腹脹等不典型癥狀為主，以至于患者未引起重視，導(dǎo)致早期確診困難，約有50%的患者在就診時已發(fā)生結(jié)腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［11］，錯過了最佳的治療時機(jī)，據(jù)統(tǒng)計結(jié)腸癌的全球死亡率高達(dá)40%以上［12-13］。雖然結(jié)腸癌的手術(shù)方式，放化療手段日益進(jìn)展，但此類患者術(shù)后的五年存活率仍不足65%［14］。因此，早期確診結(jié)腸癌至關(guān)重要。隨著腫瘤生物學(xué)的發(fā)展，相關(guān)科研人員與臨床醫(yī)生都迫切希望從基因或分子層面探究結(jié)腸癌的病因與發(fā)生機(jī)制，尋找結(jié)腸癌早期診斷的靶標(biāo)，從而使患者獲益。

人們對miRNA 認(rèn)識的不斷深入，其對腫瘤的調(diào)控作用逐漸成為研究熱點［15］，基于miRNA 與結(jié)腸癌相關(guān)性的研究也越來越多。2017 年，F(xiàn)ENG等［16］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-590-3P 可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性增殖。隨后ZHU 等［17］的研究結(jié)果顯示，miR-873-5p 可以通過抑制TUSC3/AKT 通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。2019 年，DEHGHAN 等［18］最新研究表明miR-21 可作為早期結(jié)腸癌的診斷標(biāo)記物，尤其是男性結(jié)腸癌。諸多相關(guān)研究均提示miRNA 與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系，但有關(guān)miR-28-5p 在結(jié)腸癌中的作用研究還少見報道。

miR-28-5p 作為miRNA 家族中的一員，在腎癌、卵巢癌和前列腺癌中均可發(fā)揮抑癌作用［19-21］，與此同時，miR-28-5p 在消化系統(tǒng)腫瘤中的作用也不斷被研究證實。HAN 等［22］研究表明，過表達(dá)的miR-28-5p 會促進(jìn)胰腺癌的發(fā)展。XIAO 等［23］發(fā)現(xiàn)，miR-28-5p 可以通過抑制AKT 磷酸化從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。近期有研究結(jié)果顯示［24］，miR-28-5p 可以通過IGF-1 途徑調(diào)節(jié)肝癌干細(xì)胞的增殖。在本研究首先通過qRT-PCR 實驗證實了miR-28-5p 在HCT116、SW480、SW620 三類結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)量均顯著低于正常結(jié)腸細(xì)胞，提示miR-28-5p 可能參與結(jié)腸癌發(fā)展的相關(guān)調(diào)控。隨后通過siRNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默和過表達(dá)HCT116、SW480、SW620 三類結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-28-5p 的表達(dá)水平，再通過CCK8 實驗和劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，在三類miR-28-5p 過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中，細(xì)胞增殖能力和遷移能力均降低，而在三類miR-28-5p 沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞中，細(xì)胞增殖能力和遷移能力均增強。

綜上所述，本研究初步探討了miR-28-5p 對結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)影響，結(jié)果提示miR-28-5p 具有調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，從而參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。未來我們將進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制。miR-28-5p 有望成為結(jié)腸癌新的生物標(biāo)志物和治療靶點，為結(jié)腸癌的防治提供新的思路。