王力敏 陳亞輝 楊慶山 曲日濤 姜 姜 張金池 張洪霞 宋志忠,7

(1.魯東大學(xué)農(nóng)林工程研究院 煙臺 264025； 2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 南京 210037； 3.山東省林業(yè)科學(xué)研究院 濟(jì)南 250014；4.山東省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“作物高產(chǎn)抗逆分子模塊育種實(shí)驗(yàn)室” 煙臺 264025； 5.煙臺市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心 煙臺 264001；6.海南省南繁生物安全與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海口 570100； 7.劍橋大學(xué)植物系 英國劍橋 CB2 3EA)

鉀離子(K+)是植物細(xì)胞中含量最為豐富的陽離子之一，參與光合作用、氣孔運(yùn)動(dòng)、蒸騰作用、信號傳導(dǎo)和植物抗逆等生命活動(dòng)。缺鉀阻礙植物生長和發(fā)育，影響產(chǎn)量和品質(zhì)(宋志忠等，2015；Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Véryetal., 2014; Wangetal., 2017)。

植物通過根部能從土壤中吸收足量的K+，并有效分配到不同組織部位，進(jìn)而滿足正常的生長和發(fā)育(Gaymardetal., 1998; Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Véryetal., 2014; Demidchiketal., 2014; Wangetal., 2017)。前人通過研究根部K+吸收動(dòng)力學(xué)證實(shí)了植物體內(nèi)存在2種K+吸收機(jī)制：機(jī)制Ⅰ，主要在外界K+濃度低于200 μmol·L-1時(shí)起作用，是一個(gè)典型的主動(dòng)吸鉀過程，即高親和K+吸收系統(tǒng)；機(jī)制Ⅱ，主要在外界K+濃度高于1 mmol·L-1時(shí)起作用，是一個(gè)典型的被動(dòng)吸鉀過程，即低親和K+吸收系統(tǒng)(Epsteinetal., 1963; Kochianetal., 1982; Véryetal., 2003)。特別地，定位于細(xì)胞質(zhì)膜的各類K+通道主要介導(dǎo)植物體內(nèi)K+的長距離運(yùn)輸和分配，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)特征及功能方式的不同，這些K+通道可分為3大類：Shaker家族通道、TPK家族通道和其他鉀離子通道(Gaymardetal., 1998; Lebaudyetal., 2007; Véryetal., 2014; Wangetal., 2017)。其中，Shaker類K+通道是研究最為透徹的，其對K+的親和常數(shù)約在幾十mmol，屬于典型的高通量、低親和的K+通道，在植物鉀素營養(yǎng)高效中起至關(guān)重要的作用(Grabov, 2007; Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Demidchiketal., 2014; Wangetal., 2017)。

自Anderson等(1992)和Sentenac等(1992)分別在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中揭示了植物Shaker類K+通道KAT1和AKT1，此后30年內(nèi)，陸續(xù)從不同植物中報(bào)道了40多個(gè)Shaker類K+通道(Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Hedrich, 2012; Limetal., 2019)，包括擬南芥中9個(gè)(Hedrich, 2012; Limetal., 2019)，馬鈴薯(Solanumtuberosum)SKT1(Zimmermannetal., 1998)，番茄(Solanumlycopersicum)LKT1(Hartjeetal., 2000)，胡蘿卜(Daucuscarota)KDC1(Downeyetal., 2000)和DKT1(Formentinetal., 2004)，玉米(Zeamays)KZM1、KZM2、ZMK1和ZmK2.1(Baueretal., 2000; Philipparetal., 2003; Suetal., 2005; Büchsenschützetal., 2005)，水稻(Oryzasativa)OsAKT1、OsKAT1(Otabaetal., 2007; Lietal., 2014)和大麥(Hordeumvulgare)HvAKT1、HvAKT2(Boscarietal., 2009)。根據(jù)電壓依賴性和K+在跨膜時(shí)不同的運(yùn)動(dòng)方向，又可將Shaker型K+通道分為3類：內(nèi)向整流、外向整流和弱向整流(即雙向整流)。模式植物擬南芥中，內(nèi)向整流型的K+通道包括AKT1、SPIK、KAT1和KAT2(Caoetal., 1995；Véryetal., 1995；Gaymardetal., 1996；Pilotetal., 2001；Moulineetal., 2002)，外向整流型的K+通道有SKOR和GORK(Gaymardetal., 1998; Acheetal., 2000; Hosyetal., 2003; Corratgé-Faillieetal., 2017; Limetal., 2019)，弱向整流型K+通道有AKT2/3(Lacombeetal., 2000；Dreyeretal., 2004)。

特別地，SKOR編碼一類外向整流型Shaker型K+通道。模式植物擬南芥中，SKOR通道生理功能的分子機(jī)制研究較為詳盡：AtSKOR定位于擬南芥根的中柱鞘和中柱薄壁細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)將韌皮部的K+分泌到木質(zhì)部，進(jìn)而經(jīng)由木質(zhì)部實(shí)現(xiàn)K+的根-莖長距離運(yùn)輸，同時(shí)發(fā)現(xiàn)缺失該通道功能可導(dǎo)致地上部含鉀量降低約50%，在植物生長發(fā)育過程中起重要作用(Gaymardetal., 1998)。近年來，陸續(xù)在小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)(段麗婕等，2015)、水稻(Kimetal., 2015)、霸王(Zygophyllumxanthoxylum)(Huetal., 2016)、黑果枸杞(Lyciumruthenicum)(劉麗萍等，2018)、甜瓜(Cucumismelo)(Huangetal., 2018)、葡萄(Vitisvinifera)(沈靜沅等，2020)等多種植物中報(bào)道了SKOR通道基因，且具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)特征，有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)K+通道孔(P-loop)，其中最為保守的K+通道標(biāo)簽序列為GYGD(劉麗萍等，2018; Lebaudyetal., 2007; Wardetal., 2009; Huangetal., 2018)。

雖然植物基因數(shù)據(jù)庫中能搜索到少數(shù)木本植物中Shaker類K+通道蛋白序列，但是，木本植物SKOR的功能仍然未知。本研究以山新楊(Populusdavidiana×P.bolleana)為材料，克隆PdbSKOR，明確其組織特異表達(dá)模式和電生理功能，為研究林木鉀素營養(yǎng)高效的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，并提供基因資源和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年1月—2019年10月，分別在南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、魯東大學(xué)農(nóng)林作物遺傳改良中心和劍橋大學(xué)植物系離子運(yùn)輸研究室完成。

1.1 試驗(yàn)材料與脅迫處理

供試材料為南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的3年生山新楊(雄性株)，露地生長，常規(guī)田間管理。分別于2019年不同日期采集山新楊盛開期的花(4月25日)、新生展葉(5月9日)、成熟葉片(6月20日)、1年生韌皮部(5月9日)、根(5月9號)、果絮(5月9號)組織材料，在液氮中冷凍后保存于-80 ℃冰箱。非生物脅迫處理所用材料為魯東大學(xué)農(nóng)林作物遺傳改良中心培育的山新楊組培幼苗。根據(jù)王壯偉等(2018)的描述進(jìn)行脅迫處理：在人工氣候箱中，將幼苗在1/2MS營養(yǎng)液(Murashigeetal., 1962)預(yù)培養(yǎng)3天，然后分別進(jìn)行缺鉀(MS營養(yǎng)基配方中的KH2PO4和KNO3分別用NaH2PO3和NaNO3代替)、高鉀(60 mmol·L-1KCl)、干旱(15 g·L-1PEG6000)、低溫(4 ℃)處理，每個(gè)處理9株幼苗，分別在處理4、24、48、72 h，采集幼苗根部材料，液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 楊樹PdbSKOR檢索與克隆

以擬南芥AtSKOR(Gene ID: AT3G02850)編碼蛋白的序列為參考，在Phytozome毛果楊(Populustrichocarpa)基因組(http:∥www.phytozome.net)中檢索獲得1個(gè)SKOR同源蛋白，下載毛果楊SKORCDS序列后，設(shè)計(jì)上下游引物(表1)，提取山新楊組培幼苗整株總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第1鏈cDNA模板，利用Prime STARTMHS DNA聚合酶(TaKaRa，大連)對山新楊PdbSKOR的CDS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，下載毛果楊SKOR起始密碼子ATG上游2.0 kb的啟動(dòng)子區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)上下游引物，PCR擴(kuò)增山新楊PdbSKOR的啟動(dòng)子區(qū)域；擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗(yàn)證。利用在線服務(wù)器Pfam(http:∥pfam.xfam.org/search)分析PdbSKOR蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，利用在線服務(wù)器Phyre2(http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測PdbSKOR蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.3 14種木本植物SKOR系統(tǒng)發(fā)育樹

在Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫中下載紅皮柳(Salixpurpurea)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、無油樟(Amborellatrichopoda)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)、木薯(Manihotesculenta)、可可(Theobromacacao)、葡萄、桃(Prunuspersica)、白梨(Pyrusbretschneideri)、蘋果(Malusdomestica)、番木瓜(Caricapapaya)、甜橙(Citrussinensis)和克萊門柚(Citrusclementina)13種不同木本植物SKOR同源蛋白的氨基酸序列，利用ClustalX 2.0軟件對山新楊和這13種植物同源蛋白SKOR進(jìn)行氨基酸序列一致性分析，并借助MEGA 7.0軟件構(gòu)建SKOR同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

通過MiniBEST Plant RNA提取試劑盒(TaKaRa，大連)分別提取山新楊3年生植株和組培幼苗不同組織的總RNA，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa，大連)試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得第1鏈cDNA，作為PCR反應(yīng)的模板。利用NCBI/Primer-BLAST在線服務(wù)器，設(shè)計(jì)PdbSKOR基因的特異性表達(dá)引物(表1)，以山新楊EF1β(elongation factor gene)(Yangetal., 2015)作為內(nèi)參基因，利用SYBR Green熒光染料(TaKaRa，大連)，借助ABI 7500熒光定量PCR儀(紐約，美國)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所得的Ct值經(jīng)內(nèi)參基因EF1β均一化后，利用2-ΔΔCt法(Livaketal., 2001)計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 pTracer-CMV3-SKOR表達(dá)載體構(gòu)建

分析PdbSKOR的限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，構(gòu)建表達(dá)載體pTracer-CMV3-SKOR：上游添加KpnⅠ(New England Biolabs，美國)酶切位點(diǎn)，下游添加NotⅠ(New England Biolabs，美國)酶切位點(diǎn)(表1，下劃線標(biāo)注)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ/NotⅠ雙酶切作用后，利用T4DNA連接酶(New England Biolabs，美國)，構(gòu)建到經(jīng)由KpnⅠ/NotⅠ雙酶切的pTracer-CMV3的多克隆位點(diǎn)中，即重組表達(dá)載體pTracer-CMV3-SKOR。

表1 本文所用特異性引物

1.6 膜片鉗電生理研究

利用Su等(2005)報(bào)道的方法，利用膜片鉗系統(tǒng)研究PdbSKOR的電生理功能：以轉(zhuǎn)染pTracer-CMV3空載體作為對照，將濃縮純化的pTracer-CMV3-SKOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-T細(xì)胞(ATCC公司，美國)，篩選綠色熒光標(biāo)記成功的細(xì)胞，利用pCLAMP 10.0設(shè)備(Axon，美國)采集并記錄通道電流信號，借助pCLAMP 10.0軟件采集圖像和分析數(shù)據(jù)。每個(gè)K+濃度條件下均選擇6個(gè)細(xì)胞作為生物學(xué)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)顯著性分析

借助SPSS 13.0軟件(SPSS Chicago，美國)對全文數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，在對照和脅迫處理?xiàng)l件下2個(gè)獨(dú)立樣品間進(jìn)行t-檢驗(yàn)(*：0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹PdbSKOR的克隆

以擬南芥AthSKOR(At3g02850)編碼序列作為參考序列，在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到1個(gè)同源蛋白SKOR(Potri.017G135400)，下載山新楊SKOR基因的CDS序列并設(shè)計(jì)上下游引物，提取山新楊組培幼苗整株總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第1鏈cDNA模板，PCR擴(kuò)增山新楊PdbSKOR基因的CDS序列，克隆到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，篩選陽性克隆子，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，獲得山新楊PdbSKOR的CDS序列，含有2 526 bp，編碼841個(gè)氨基酸，提交NCBI數(shù)據(jù)庫獲得GenBank登錄號MT335814(表2)。利用Pfam在線服務(wù)器在PdbSKOR蛋白中檢測到離子通道跨膜域(S1—S6，PF00520)、環(huán)核苷酸結(jié)合域(cNBD，PF00027)、KHA二聚體結(jié)構(gòu)域(PF11834)和ankyrin錨蛋白域(ANKY，PF12796)等功能結(jié)構(gòu)域(圖1)，并鑒定了極為保守的通道特征標(biāo)簽序列GYGD，暗示PdbSKOR是一個(gè)典型的K+外排型通道。此外，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明山新楊PdbSKOR和紅皮柳SpuSKOR具有類似的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)(圖2)。

表2 14種木本植物SKOR蛋白信息

2.2 14種木本植物SKOR同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

在Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫分別鑒定山新楊(楊柳科Salicaceae)、紅皮柳(楊柳科)、巨桉(桃金娘科Myrtaceae)、無油樟(無油樟科Amborellaceae)、雷蒙德氏棉(錦葵科Malvaceae)、木薯(大戟科Euphorbiaceae)、可可(梧桐科Sterculiaceae)、葡萄(葡萄科Vitaceae)、桃(薔薇科Rosaceae)、白梨(薔薇科)、蘋果(薔薇科)、番木瓜(薔薇科)、甜橙(蕓香科Rutaceae)和克萊門柚(蕓香科)14種木本植物的SKOR蛋白，并下載氨基酸序列(表2和圖1)。多重氨基酸序列比對結(jié)果表明：14種植物SKOR蛋白具有相似的氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征，均含有6個(gè)保守的跨膜區(qū)，即S1—S6，在跨膜區(qū)S5和S6之間有1個(gè)通道孔P環(huán)結(jié)構(gòu)(P-loop)，且包含一段極保守的標(biāo)簽序列GYGD(圖1)；不同科、屬植物SKOR蛋白具有較高的相似性，兩兩物種之間SKOR蛋白氨基酸序列的一致性均高于85%，14種植物SKOR同源蛋白在氨基酸水平仍然具有81.09%的一致性，特別是S1至S6區(qū)間，氨基酸序列一致性極高，其中S6跨膜區(qū)的一致性最高，達(dá)到96%(圖1)。

圖1 14種木本植物SKOR結(jié)構(gòu)域預(yù)測及氨基酸序列一致性分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)分析表明：14種不同科屬木本植物的SKOR蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上有較大差異，而同一科屬植物在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上更傾向于聚在一起。山新楊和紅皮柳同為楊柳科植物，山新楊PdbSKOR和紅皮柳SpuSKOR系統(tǒng)進(jìn)化樹上距離最為相近，二者又與木薯(大戟科)MesSKOR和巨桉(桃金娘科)EgrSKOR同源蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹上緊密聚在一起；甜橙和克萊門柚同為蕓香科植物，其同源蛋白CsiSKOR和CclSKOR在系統(tǒng)進(jìn)化樹上緊密聚在一起；蘋果、白梨和桃同屬薔薇科植物，其同源蛋白MdoSKOR、PbrSKOR和PpeSKOR在系統(tǒng)進(jìn)化樹上更傾向于聚在一起，而同屬薔薇科的番木瓜CpaSKOR卻與雷蒙德氏棉(錦葵科)GraSKOR和可可(梧桐科)TcaSKOR在系統(tǒng)進(jìn)化樹上緊密聚在一起；此外，葡萄科VviSKOR和無油樟科AtrSKOR與上述同源蛋白在進(jìn)化關(guān)系上距離較遠(yuǎn)。

圖3 14種木本植物SKOR蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 PdbSKOR啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測

順式作用元件分析結(jié)果表明：PdbSKOR啟動(dòng)子中擁有至少18種順式作用元件(表3)，包括發(fā)育調(diào)控(種子特異性、玉米醇溶蛋白代謝、分生組織等)、激素響應(yīng)(赤霉素、脫落酸、水楊酸、生長素等)、脅迫響應(yīng)(光感應(yīng)、低溫感應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)等)等不同生命活動(dòng)相關(guān)的調(diào)控元件(表3)。

表3 PdbSKOR啟動(dòng)子順式作用元件

2.4 PdbSKOR的表達(dá)模式

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明：PdbSKOR在3年生山新楊多種組織或器官中均有表達(dá)，且在不同組織或器官中的相對表達(dá)量差異較大，在根部的表達(dá)量最高，其次是花中(盛開期花和花序)，在莖部、成熟葉片、新生展葉和果絮中的表達(dá)水平較低(圖4)；此外，PdbSKOR在山新楊組培幼苗中根部的相對表達(dá)水平也是最高的，在莖部和葉片的表達(dá)量相對較低(圖4)；推測該基因可能主要在山新楊根部鉀素營養(yǎng)過程中發(fā)揮功能。

圖4 PdbSKOR在3年生植株和組培幼苗不同組織中的表達(dá)特征

2.5 PdbSKOR對不同脅迫處理的響應(yīng)

根據(jù)順式作用元件預(yù)測及表達(dá)分析結(jié)果，以山新楊組培幼苗為材料，設(shè)置缺鉀、高鉀、干旱和低溫等非生物脅迫處理，并以根部為材料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果表明：PdbSKOR在轉(zhuǎn)錄水平對不同非生物脅迫的響應(yīng)情況存在差異，對缺鉀、低溫和干旱脅迫最為敏感，而對高鉀處理無響應(yīng)；缺鉀和干旱脅迫持續(xù)降低PdbSKOR在幼苗根部的表達(dá)量，低溫處理則持續(xù)增強(qiáng)PdbSKOR在幼苗根部的表達(dá)量(圖5)。

圖5 組培幼苗中PdbSKOR對缺鉀、高鉀、干旱和低溫處理的響應(yīng)

2.6 PdbSKOR的電生理功能

利用膜片鉗系統(tǒng)采集和記錄pTracer-CMV3-SKOR在胞外不同K+濃度條件下電流與膜電壓的特征曲線(圖6)：轉(zhuǎn)染pTracer-CMV3-SKOR的細(xì)胞記錄到大量的外向型電流(已扣除空白對照的標(biāo)準(zhǔn)化電流)，且隨胞外K+濃度的降低而增大，即胞外K+濃度為100 mmol·L-1時(shí)，記錄到的電流最低，而胞外0 mmol·L-1時(shí)，記錄到的電流最高；此外，當(dāng)細(xì)胞膜電位于+20 mV時(shí)，PdbSKOR通道被激活，出現(xiàn)外向整流電流，且正向電壓越大，外向整流的電流越強(qiáng)，是典型的電壓依賴型K+通道。因此，膜片鉗電生理功能研究表明PdbSKOR是一個(gè)典型的電壓依賴型的外排型K+通道。

3 討論

植物SKOR基因編碼外向整流型的Shaker類K+通道蛋白，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育過程(Gaymardetal., 1998; Véryetal., 2014)。除擬南芥外，僅有少數(shù)其他植物的SKOR基因被鑒定和報(bào)道(Véryetal., 2014; Huangetal., 2018)。全世界共有650種楊柳科植物，尚未見任何楊柳科SKOR通道蛋白的報(bào)道。近20年來，基因組測序技術(shù)為植物科學(xué)研究提供了便利。本研究發(fā)現(xiàn)山新楊PdbSKOR蛋白擁有植物Shaker類K+通道所特有的功能結(jié)構(gòu)域，特別是GYGD通道標(biāo)簽序列(Véryetal., 2003; 2014)。雖然不同科屬木本植物SKOR同源蛋白的核心跨膜區(qū)域具有極高的序列一致性(圖1)，但在遺傳進(jìn)化關(guān)系上存在差異(圖3)，而同一科屬植物SKOR同源蛋白的一致性相對較高，在遺傳進(jìn)化距離上也更為相近(圖3)。特別地，山新楊PdbSKOR和紅皮柳SpuSKOR在所檢測木本植物SKOR蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹中緊密聚在一起，二者具有極高的氨基酸序列一致性(94.54%)，其中S6跨膜區(qū)的一致性達(dá)到98.26%，此外，PbdSKOR和SpuSKOR的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)極其相似。高度相似的氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu),暗示二者具有類似的生理功能。因此，解析山新楊PdbSKOR通道的功能，為研究楊柳科SKOR同源蛋白的功能提供了理論依據(jù)。

在生理學(xué)功能層面，SKOR通道屬于典型的Shaker類外向整流型K+通道，已在擬南芥(Gaymardetal., 1998)、甜瓜(Huangetal., 2018)和葡萄(沈靜沅等，2020)中利用非洲爪蛙卵和雙電極電壓鉗技術(shù)得到證實(shí)，而利用膜片鉗技術(shù)研究SKOR功能的報(bào)道少見。本研究借助膜片鉗系統(tǒng)揭示山新楊PdbSKOR具有外向整流型K+通道的電流特征：外排型K+電流，通道活性具有電壓依賴性且受胞外K+濃度調(diào)控(圖6)，與擬南芥AtSKOR和甜瓜CmSKOR的K+電流特征(Gaymardetal., 1998; Huangetal., 2018; 沈靜沅等，2020)類似，但是電流強(qiáng)度、電流與膜電位的關(guān)系曲線差異顯著，暗示林木類SKOR通道的功能與1年生植物同源蛋白的功能存在較大差異。盡管PdbSKOR通道運(yùn)輸K+的特點(diǎn)和具體調(diào)控機(jī)理還尚未開展研究，但本文工作為研究木本植物SKOR同源蛋白的功能提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

模式植物擬南芥和水稻中，SKOR主要在根中柱鞘細(xì)胞中表達(dá)(Gaymardetal., 1998; Kimetal., 2015)，這些SKOR通道基因所具有的細(xì)胞特異性表達(dá)模式，可能是通道維持特定功能和植物生長所必不可少的。本研究中，PdbSKOR主要在山新楊根部表達(dá)，與在其他植物中的報(bào)道(Gaymardetal., 1998; 段麗婕等，2015; Kimetal., 2015; Huetal., 2016; Huangetal., 2018; 沈靜沅等，2020)相一致，證實(shí)SKOR通道基因主要在植物根部的鉀素營養(yǎng)動(dòng)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

已有研究證實(shí)Shaker類型通道在植物K+動(dòng)態(tài)平衡和滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且在轉(zhuǎn)錄水平受外界K+濃度、干旱、NaCl、ABA等非生物脅迫的調(diào)控(Gaymardetal., 1998; 段麗婕等，2015; Liuetal., 2013; Demidchiketal., 2014; Kimetal., 2015; Huetal., 2016; Huangetal., 2018；Limetal., 2019)，但對低溫脅迫的響應(yīng)特征還不清晰。本研究發(fā)現(xiàn)，與電生理通道活性受胞外K+濃度調(diào)控相一致的是，PdbSKOR在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量也受外界K+濃度調(diào)控，缺鉀處理顯著抑制PdbSKOR的表達(dá)水平(圖5)，這些結(jié)果與擬南芥(Gaymardetal., 1998)、霸王(Huetal., 2016)、甜瓜(Huangetal., 2018)和葡萄(沈靜沅等，2020)中的報(bào)道是相似的。因此推測在缺鉀情況下，植物根部沒有太多的K+往地上部分運(yùn)輸，進(jìn)而減少了SKOR通道的需求量，引起SKOR基因表達(dá)水平的降低。

本研究中，在山新楊PdbSKOR啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到干旱誘導(dǎo)和低溫感應(yīng)的順式作用元件(表3)。PEG6000模擬干旱顯著降低PdbSKOR基因在根部的表達(dá)量(圖5)，表明該基因在干旱環(huán)境中可能更傾向于停止或降低其在根部轉(zhuǎn)運(yùn)K+的作用，進(jìn)而減少干旱脅迫對山新楊根系的毒害，以便維持根系基本生長；低溫處理(4 ℃)顯著增強(qiáng)PdbSKOR在根部的表達(dá)量(圖5)，推測在低溫環(huán)境中，PdbSKOR通道活性被誘導(dǎo)而增強(qiáng)了將根部K+向地上部運(yùn)輸?shù)哪芰?，以便在地上部迅速富集較多的K+，保障山新楊地上部的各種依賴K+而必需的生命活動(dòng)，進(jìn)而適應(yīng)和抵抗低溫不利環(huán)境的影響。這些發(fā)現(xiàn)，直接證實(shí)SKOR通道的活性易受干旱和低溫脅迫的調(diào)控，然而，具體機(jī)制依然未知。此外，PdbSKOR對高鉀處理無響應(yīng)，暗示山新楊根部SKOR豐度足以維持其在高鉀環(huán)境中持續(xù)發(fā)揮作用。綜上可知，PdbSKOR主導(dǎo)山新楊根部K+外排，參與維持植物體內(nèi)鉀素動(dòng)態(tài)平衡，并可能在楊樹適應(yīng)干旱和低溫脅迫方面發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

從山新楊中鑒定并克隆了PdbSKOR，它是一個(gè)具電壓依賴性的外排型K+通道；山新楊PdbSKOR與紅皮柳SpuSKOR在進(jìn)化關(guān)系上最近；PdbSKOR主要在山新楊根部表達(dá)，并在轉(zhuǎn)錄水平受缺鉀或干旱的抑制均顯著降低，受低溫脅迫誘導(dǎo)而顯著增強(qiáng)。