梅增霞，李建慶

（1 濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東濱州 256603；2 濱州學(xué)院教務(wù)處）

DNA 分析技術(shù)廣泛用于種群分化、系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)研究，也是生物類(lèi)專(zhuān)業(yè)學(xué)生需要掌握和熟練應(yīng)用的一門(mén)技術(shù)。利用DNA 進(jìn)行生物系統(tǒng)學(xué)分析，通常要求學(xué)生在掌握DNA 提取、PCR 擴(kuò)增技術(shù)之后，就對(duì)目的DNA 拼接和分析，因此，拼接出準(zhǔn)確的DNA 序列是開(kāi)展其他DNA 分析關(guān)鍵和基礎(chǔ)。

云斑白條天牛是黃河三角洲地區(qū)為害白蠟樹(shù)的重要害蟲(chóng)，危害嚴(yán)重，發(fā)生量大，成蟲(chóng)個(gè)體較大，基因組DNA 的提取比較容易。線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I（COI）是一個(gè)較為保守的基因序列，經(jīng)常用于昆蟲(chóng)種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育和分化的研究[1]，目前已有部分對(duì)云斑白條天牛COI 的相關(guān)研究[2-4]，可為該實(shí)驗(yàn)前期的DNA 提取和PCR 擴(kuò)增提供借鑒。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是筆者從事云斑白天牛種群分化研究工作的部分內(nèi)容，項(xiàng)目組從當(dāng)?shù)刂匾οx(chóng)云斑白條天牛中成功提取并擴(kuò)增了COI 基因，為該實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展做好了前期準(zhǔn)備。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合黃河三角洲地域特色，以當(dāng)?shù)刂匾οx(chóng)云斑白條天牛為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，提取擴(kuò)增其COI 基因，以COI 基因?yàn)槔?，利用DNAStar 基因分析軟件進(jìn)行基因序列拼接，并比較拼接方法和拼接結(jié)果，對(duì)提升學(xué)生綜合實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力均有重要作用。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1 DNA 提取

在濱州城區(qū)的白蠟樹(shù)上采集云斑白條天牛成蟲(chóng)，然后進(jìn)行DNA 提取。

1.2 DNA 擴(kuò)增測(cè)序

設(shè)計(jì)云斑白條天牛雌成蟲(chóng)COI 基因引物，PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增后DNA 提交上海生工公司雙向測(cè)序，測(cè)序完成后，公司提供的abl 文格式件分別為DNA 雙鏈的3' 端序列和5' 端序列，文件較大分別為310KB 和259KB，含不同堿基的圖譜。seq 格式文件較小，僅為1KB，含堿基序列。

1.3 基因序列拼接和分析軟件

利用DNAStar 軟件的SeqMan 程序拼接基因序列，利用MegAlign 程序比對(duì)序列。

2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1 Seq 序列文件的拼接

打開(kāi)DNAStar 的SeqMan 程序，輸入2 個(gè)seq 序列文件，將2 個(gè)序列進(jìn)行拼接，拼接后序列長(zhǎng)度716 bp。

點(diǎn)擊菜單欄Contig 的Strategy View，打開(kāi)Strategy窗口（圖1），勾取Conflicts 選項(xiàng)后，通過(guò)彩色區(qū)塊，快速查找沖突堿基，由圖4 可見(jiàn)，選取的前80 個(gè)堿基中，在堿基序列30～40 和40～50 之間有沖突堿基。

圖1 seq 序列文件裝配序列的Strategy 窗口

點(diǎn)擊Contig 的Alignment View，打開(kāi)Alignment 窗口，通過(guò)圖2 可見(jiàn)，拼接裝配前2 個(gè)序列的長(zhǎng)度分別是685 bp 和681 bp，根據(jù)圖1 查看的結(jié)果，在拼接后總長(zhǎng)度的716 bp 中選取前80 個(gè)堿基進(jìn)行比較，在序列30～40 和40～50 之間查找沖突堿基，在圖2 上有5 處拼接沖突的地方，1 處堿基不一致，4 處堿基缺失。

拼接裝配時(shí)，需要對(duì)沖突堿基和缺失堿基進(jìn)行修補(bǔ)，缺失堿基可根據(jù)另一條鏈對(duì)應(yīng)的堿基進(jìn)行填補(bǔ)，但沖突堿基軟件不能確定哪個(gè)是正確的，如圖2 的序列35 位點(diǎn)處的2 條鏈的堿基分別A 和C，軟件裝配時(shí)以M 作為該位點(diǎn)堿基輸出序列結(jié)果。

圖2 seq 序列文件裝配序列的Alignment 窗口

2.2 Abl 圖譜文件的拼接

在SeqMan 程序中輸入2 個(gè)abl 圖譜文件，將2 個(gè)序列進(jìn)行拼接裝配，裝配拼接后序列長(zhǎng)度705 bp。

由圖3 的Strategy 窗口可見(jiàn)，在拼接后的705 bp中選取前80 個(gè)堿基進(jìn)行比較，在30～40 和40～50 序列位置之間有沖突堿基。根據(jù)圖4 的Alignment 窗口，拼接裝配前2 個(gè)序列的長(zhǎng)度分別是680 bp 和675 bp，根據(jù)圖3 確定堿基沖突位置，在圖4 上有4 處堿基拼接沖突位置，2 處為堿基不一致，2 處是堿基缺失。修補(bǔ)沖突堿基時(shí)參考圖譜波峰，如圖5 局部放大，可確定缺失的39 和44 位點(diǎn)的2 個(gè)堿基分別為T(mén) 和A；32 位點(diǎn)處沖突堿基A 和C 不匹配，根據(jù)圖譜的波峰可以確定為A，因?yàn)閴A基A 波峰清晰明顯，而堿基C 處無(wú)波峰；50位點(diǎn)處堿基A 的綠色波峰和黑色波峰幾乎重疊，很難確定是堿基A 還是G，因此軟件將以R 作為堿基裝配序列結(jié)果輸出，這是需要重新測(cè)序才能確定該位置的堿基名稱(chēng)。

圖3 abl 圖譜文件裝配序列的Strategy 窗口

圖4 abl 圖譜文件裝配序列的Alignment 窗口

前文2.1 提及的序列文件拼接序列35 位點(diǎn)處的沖突堿基A 和C 與圖譜文件拼接序列的32 位點(diǎn)處為同一堿基位點(diǎn)，因此根據(jù)圖譜文件可以確定圖2 序列文件35 位點(diǎn)處堿基為A。

圖5 abl 圖譜文件裝配序列30～50 位點(diǎn)的放大圖

2.3 拼接序列的比較

通過(guò)2 種方法得到云斑白條天牛成蟲(chóng)COI 的2 條拼接序列，abl 圖譜文件拼接后，輸出序列命名為BC-COI-abl，seq 序列文件拼接后，輸出序列命名為BC-COI-seq。通過(guò)DNAStar 的MegAlign 程序比較2 條序列的差異，結(jié)果顯示，BC-COI-abl 序列長(zhǎng)度705bp，比較的堿基位點(diǎn)為1-705，BC-COI-seq 序列長(zhǎng)度716 bp，比較的堿基位點(diǎn)為7～711，比較的堿基序列長(zhǎng)度為705 bp，無(wú)堿基缺口，2 個(gè)序列的相似度為99%。2 條序列的堿基比對(duì)結(jié)果，由圖6 可見(jiàn)，2 種拼接方法得到序列有7 處位點(diǎn)堿基不一致，原因均為BC-COI-seq 序列拼接時(shí)含有沖突基因不能確定準(zhǔn)確堿基。

圖6 拼接序列BC-COI-abl 和BC-COI-seq 的堿基比較

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)過(guò)程的比較和分析，可以得出2 個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)論：①2 個(gè)文件拼接序列不一致，abl 文件拼接的基因序列較seq 文件拼接的序列堿基準(zhǔn)確性更高。Seq 文件拼接序列存在一些不準(zhǔn)確堿基，這些不準(zhǔn)確堿基可通過(guò)觀察abl 文件不同堿基位的波峰圖譜來(lái)確定，較好波峰對(duì)應(yīng)的堿基為正確堿基。②利用seq 文件拼接的序列長(zhǎng)度大于利用abl 文件拼接的序列。seq 文件拼接后COI 基因的序列長(zhǎng)度716 bp，abl 文件拼接的COI 基因序列長(zhǎng)度為705 bp。

4 討論

通常認(rèn)為DNA 序列在1000 bp 以?xún)?nèi)的基因，測(cè)序公司提供的seq 格式文件的堿基序列是較為準(zhǔn)確的，可以直接用于DNA 分析。seq 文件小占用內(nèi)存少，進(jìn)行序列拼接時(shí)拼接過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，缺失堿基可以利用另一條鏈的堿基自行填補(bǔ)，可快速輸出拼接序列，但拼接時(shí)遇到?jīng)_突堿基，無(wú)法確定哪一個(gè)堿基是正確的，導(dǎo)致輸出序列中含有非堿基字母。abl 文件較大占用內(nèi)存多，拼接過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，但拼接結(jié)果準(zhǔn)確可靠，通過(guò)觀察不同堿基位的圖譜波峰，確定正確堿基，個(gè)別情況下軟件拼接錯(cuò)誤的堿基也可通過(guò)觀察波峰來(lái)確定。

作者在指導(dǎo)學(xué)生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)基因拼接是一個(gè)很基本的DNA 技術(shù)，但學(xué)生實(shí)際掌握情況并不好，這一實(shí)驗(yàn)把DNA 技術(shù)的實(shí)驗(yàn)理論結(jié)合地方實(shí)際問(wèn)題，以當(dāng)?shù)睾οx(chóng)云斑白條天牛的COI 基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，結(jié)合自身科研過(guò)程和開(kāi)發(fā)適合學(xué)生實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目對(duì)鍛煉學(xué)生解決實(shí)際問(wèn)題能力，提高大學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣有很大幫助。該實(shí)驗(yàn)也可與其他實(shí)驗(yàn)如DNA 提取、PCR 擴(kuò)增、基因比對(duì)等內(nèi)容結(jié)合而組成一個(gè)研究性實(shí)驗(yàn)，若適當(dāng)增加研究?jī)?nèi)容或改變實(shí)驗(yàn)對(duì)象，也可用作學(xué)生畢業(yè)論文題目。因此，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以DNA 拼接方法這一實(shí)驗(yàn)技術(shù)為出發(fā)點(diǎn)，以點(diǎn)帶面，提升學(xué)生綜合運(yùn)用知識(shí)能力、邏輯思維能力和創(chuàng)新能力均有重要作用。