徐喆，王常安，劉紅柏，韓世成，陸紹霞，馮淇元，3

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210000； 3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

三倍體虹鱒Oncorhynchusmykiss具有不育性、生長速度快、飼料系數(shù)低等特點(diǎn)，是中國鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)中主要的養(yǎng)殖品種。在養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖環(huán)境變化、飼料品質(zhì)不佳等因素，導(dǎo)致魚體免疫力降低，易感染病原菌，此時(shí)，一般可通過施用免疫增強(qiáng)劑等來增強(qiáng)魚體的抗應(yīng)激、抗感染能力[1]。

低聚木糖(xylooligosaccharide，XOS)，又名木寡糖，是一種功能性聚合糖，由β-(1, 4)-糖苷鍵連接的2～7個(gè)D-木糖組成，有效成分是木二糖和木三糖，XOS具有優(yōu)于其他功能性聚合糖的理化性質(zhì)，如耐高溫、耐酸、抗凍性、無配伍禁忌[2]。近年來，在異育銀鯽Carassiusauratusgibelio、草魚Ctenopharyngodonidella、大菱鲆Scophthalmusmaximus和庫圖擬鯉Rutilusfrisiikutum等試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，XOS對(duì)機(jī)體的生長性能和免疫防御能力均有不同程度的改善[3-6]，也可提高羅非魚Oreochromisniloticus的抗氧化功能和先天免疫反應(yīng)，維持機(jī)體健康生長[7]。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為0.1～100 μg/mL的XOS可抑制TNF-α基因的表達(dá)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，有效降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥發(fā)生。但總的來說，有關(guān)XOS對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的營養(yǎng)生理作用還較為有限，其機(jī)制尚不明確。本研究中，通過在三倍體虹鱒基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的XOS，以魚體生長、血清與腸道抗氧化能力和腸道炎癥因子基因?yàn)橹笜?biāo)評(píng)價(jià)XOS對(duì)機(jī)體的影響，旨在為三倍體虹鱒功能性添加劑篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用初始體質(zhì)量為(20.85±0.48)g的三倍體虹鱒幼魚450尾，購自遼寧本溪艾格莫林虹鱒養(yǎng)殖公司。XOS購自河南鶴壁泰新科技有限公司，純度為95%。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的制備 根據(jù)魚類自身的營養(yǎng)需求，以魚粉(蒸汽白魚粉，含粗蛋白質(zhì)66.2%、粗脂肪5.92%)和大豆粕為蛋白源，魚油和磷脂為脂肪源，次粉為主要糖源，配制成基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照組，飼料配方見表1，基礎(chǔ)飼料中含粗蛋白質(zhì)40.0%、粗脂肪9.0%。

表1 基礎(chǔ)飼料組成(風(fēng)干基礎(chǔ))

②礦物質(zhì)元素(每kg飼料)：Fe 25 mg,Cu 3 mg, Mn 15 mg, I 0.6 mg, Mg 0.7 g,Zn 65 mg, Co 0.1 mg, Se 0.1 mg。

Note：①Vitamin premix containing(per kg diet) VC, 100 mg; VE, 60 mg; VK3,5 mg; VA, 15 000 IU; VD3, 3 000 IU; VB1,15 mg; VB2, 30 mg; VB6,15 mg; VB12,0.5 mg; nicotinic acid,175 mg；inositol,1 000 mg；biotin,2.5 mg；and calcium pantothenate,50 mg.

②Mineral premix containing(per kg diet) Fe 25 mg, Cu 3 mg, Mn 15 mg， I 0.6 mg, Mg 0.7 g, Zn 65 mg, Co 0.1 mg, and Se 0.1 mg.

在基礎(chǔ)飼料中分別添加不同水平的XOS(0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，制成5種試驗(yàn)飼料。具體方法如下：將飼料原料過0.18 mm的目篩后用鼓式混合機(jī)混勻，再將溶于水后的XOS添加到混合原料中攪拌均勻，用小型制粒機(jī)擠壓制粒(直徑為1.5 mm)，用烘干機(jī)干燥，置于-20 ℃下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 將試驗(yàn)魚在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)14 d。試驗(yàn)設(shè)5組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾，投喂含有不同水平XOS的5種試驗(yàn)飼料，每日按照魚體質(zhì)量的3%投喂。養(yǎng)殖環(huán)境：水源為自來水，水溫為12～18 ℃，溶氧>6 mg/L，氨氮<0.1 mg/L，pH為6.5～6.8，飼養(yǎng)時(shí)間為56 d。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后饑餓24 h，測(cè)定每組魚的體質(zhì)量，并計(jì)算增重率(WGR)、特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)等生長指標(biāo)，計(jì)算公式為

WGR=(mt-m0)/m0×100%,

SGR=(lnmt-lnm0)/t×100%,

FCR=mf/(mt-m0)。

其中：mt為終末魚體質(zhì)量(g)；m0為初始魚體質(zhì)量(g)；mf為飼料攝入量(g)；t為養(yǎng)殖時(shí)間(d)。

1.2.3 血清和腸道抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 從每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取9尾魚(每個(gè)重復(fù)3尾魚)，用MS-222(0.5 mL/L)麻醉后，使用1.5 mL注射器從尾靜脈采血，4 ℃下靜置30 min后，以12 000 r/min離心15 min，取上清液，置于冰箱(-80 ℃)中保存，用于血清抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。

將采集血液后的試驗(yàn)魚于托盤中解剖，采集腸道樣品，并剔除腸系膜脂肪和腸道內(nèi)容物。取腸組織0.5 g加入1 mL PBS在冰浴上用勻漿機(jī)攪拌，加PBS至5 mL，取2 mL研磨液以10 000 r/min離心15 min，取上清液，置于冰箱(-80 ℃)中保存，用于腸道抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)活性和溶菌酶(LZM)含量的測(cè)定均使用建成(南京)生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。

1.2.4 腸道炎癥因子基因表達(dá) 試驗(yàn)選用魯氏耶爾森菌Yersiniaruckeri進(jìn)行免疫刺激，參考本實(shí)驗(yàn)室馮淇元等[9]對(duì)虹鱒的應(yīng)用結(jié)果，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得出魯氏耶爾森菌濃度為8.4×106CFU/mL時(shí)，可致魚患病且特征明顯，因此，本試驗(yàn)中通過注射微量病菌誘發(fā)虹鱒的炎癥反應(yīng)，進(jìn)行腸道炎癥因子相關(guān)基因(IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α和PepT1)表達(dá)的測(cè)定。

采用“1.2.3節(jié)”中的方法采集試驗(yàn)魚腸道樣品，置于冰箱(-80 ℃)中保存。將凍存的腸道組織研磨成粉狀，用Trizol法對(duì)腸組織中的RNA進(jìn)行分離、沉淀、洗脫、溶解和保存，使用TaKaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA模板并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.2.5 引物設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)中所用引物參考虹鱒IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α和PepT1基因的引物序列[10-13](表2)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加XOS后虹鱒生長性能的變化

從表3可見：飼料中添加XOS對(duì)增重率和特定生長率有一定影響，各試驗(yàn)組增重率和特定生長率隨XOS添加量的增加而提高，當(dāng)添加量為1.00%時(shí)達(dá)最高值，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其余各組無顯著性差異(P>0.05)；飼料系數(shù)隨XOS添加量的增加略有降低，未達(dá)顯著性水平(P>0.05)。

表2 Real-time PCR目標(biāo)基因與內(nèi)參基因引物序列

表3 飼料中添加XOS對(duì)虹鱒生長性能的影響

2.2 飼料中添加XOS后虹鱒血清和腸道抗氧化指標(biāo)的變化

從表4可見：飼料中XOS的添加量對(duì)虹鱒血清SOD、LZM活性和MDA含量具有影響，與對(duì)照組相比，0.50%、0.75%、1.00%組SOD、LZM活性顯著升高(P<0.05)，1.00%組MDA含量顯著降低(P<0.05)；XOS對(duì)CAT活性無顯著性影響(P>0.05)。

表4 飼料中添加XOS對(duì)虹鱒血清抗氧化指標(biāo)的影響

從表5可見：飼料中添加XOS對(duì)腸道SOD、CAT和LZM活性具有一定影響，隨XOS添加量的增加，SOD、CAT和LZM活性呈先升高后降低趨勢(shì)；XOS添加量為0.75%時(shí)，SOD、CAT、LZM活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；隨XOS添加量的增加，MDA含量有降低趨勢(shì)，但無顯著性差異(P>0.05)。

表5 飼料中添加XOS對(duì)虹鱒腸道抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 飼料中添加XOS后虹鱒腸道炎癥因子和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)量的變化

從圖1可見：飼料中添加XOS對(duì)腸道白介素IL-1β、IL-8基因和腫瘤壞死因子TNF-α基因的表達(dá)量均有影響；隨XOS添加量的增加，IL-1β、IL-8和TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，分別在0.75%組、0.50%組和0.75%組達(dá)最高值，且均與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示同一基因中不同XOS質(zhì)量分?jǐn)?shù)組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters in same gene are significant differences in different XOS mass fraction groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.圖1 飼料中添加XOS對(duì)虹鱒腸道IL-1β、IL-8和TNF-α基因表達(dá)量的影響Fig.1 Effects of dietary xylooligosaccharide supplementation on expression of IL-1β,IL-8 and TNF-α genes in rainbow trout

從圖2可見：飼料中添加不同水平XOS對(duì)虹鱒腸道白細(xì)胞介素IL-2和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1基因表達(dá)量均有一定影響；IL-2基因表達(dá)量在0.25%組達(dá)最高值，且顯著高于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組(P<0.05)；PepT1基因表達(dá)量在0.75%組達(dá)最高值，且顯著高于對(duì)照組、0.25%組和1.00%組(P<0.05)。

圖2 飼料中添加XOS對(duì)虹鱒腸道IL-2和PepT1基因表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of dietary xylooligosaccharide supplementation on expression of intestinal IL-2 and PepT1 genes in rainbow trout

3 討論

3.1 飼料中添加XOS對(duì)虹鱒生長性能的影響

飼料中添加XOS可提高魚體生長性能。有研究表明，與對(duì)照組相比，在異育銀鯽飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的XOS時(shí)，可提高其生長性能且消化酶活性最強(qiáng)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，XOS可顯著提高虹鱒的增重率和特定生長率，但對(duì)飼料系數(shù)無明顯影響。這可能是由于XOS可促進(jìn)腸道有益菌增殖，并加快腸道蠕動(dòng)，促進(jìn)腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)，從而改善生長性能[15]。

3.2 飼料中添加XOS對(duì)虹鱒抗氧化能力和非特異性免疫的影響

3.3 飼料中添加XOS對(duì)虹鱒腸道炎癥因子和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)量的影響

白細(xì)胞介素參與機(jī)體免疫反應(yīng)的表達(dá)和調(diào)節(jié)，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化。IL-1β是由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活后經(jīng)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種多效炎癥細(xì)胞因子，對(duì)淋巴細(xì)胞的生長和增殖有直接影響，IL-1β通過刺激效應(yīng)細(xì)胞增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)，是特異性免疫和非特異性免疫反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子[23]。IL-2為T細(xì)胞生長因子，由IL-1β刺激分泌，通過活化T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表達(dá)促進(jìn)免疫反應(yīng)，并有效控制免疫應(yīng)答[24-25]。IL-8是典型的促炎癥因子，在白細(xì)胞的趨化性和功能中具有重要作用，對(duì)恢復(fù)感染組織有一定作用[26]。TNF-α由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是參與白細(xì)胞遷移、增殖分化及凋亡的重要免疫因子，在炎癥反應(yīng)中刺激免疫細(xì)胞并介導(dǎo)免疫應(yīng)答，具有殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞的功效[27]。Tafalla等[28]發(fā)現(xiàn)，在虹鱒的肝臟、頭腎和脾臟中IL-1β均為組成性表達(dá)。飼料中添加XOS可顯著上調(diào)草魚腎臟、脾臟免疫相關(guān)基因IL-1β和TNF-α的表達(dá)[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，XOS顯著影響虹鱒腸道炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)IL-1β、IL-2、IL-8和TNF-α基因有先上調(diào)后下調(diào)的作用，其中，對(duì)IL-1β的影響最為明顯。外界刺激能夠誘導(dǎo)IL-1β的表達(dá)[30]，這表明魚體在飼喂XOS的免疫初期，炎癥因子刺激各種免疫細(xì)胞增殖，隨著XOS添加量的提高，炎癥因子在不同的添加量下達(dá)到峰值，這說明XOS能夠作用于免疫防御系統(tǒng)，提高免疫因子的表達(dá)量，提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫力，能對(duì)病原菌及病毒的抵御起到一定作用，保護(hù)機(jī)體健康生長[31]。但是，當(dāng)XOS含量過高時(shí)，則抑制了機(jī)體的免疫反應(yīng)，因此，高水平添加劑不利于保持機(jī)體內(nèi)部的動(dòng)態(tài)平衡[32]。

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1主要位于腸道上皮細(xì)胞，它是一種完整的膜蛋白載體，主要參與腸道內(nèi)小肽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，通過轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽為機(jī)體運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育，同時(shí)也參與炎癥反應(yīng)的免疫應(yīng)答，在炎癥細(xì)胞因子通訊中發(fā)揮作用[33-34]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PepT1基因隨XOS添加水平的提高呈先升高后降低的趨勢(shì)，并以0.75%組為最高，且與對(duì)照組有顯著性差異。XOS對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物的作用是通過對(duì)腸道有益菌的增殖，進(jìn)而改善腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)機(jī)體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)[35]。本試驗(yàn)飼料中添加低水平的XOS對(duì)腸道有益菌的增殖有積極作用，上調(diào)了PepT1基因表達(dá)量并促進(jìn)腸道對(duì)小肽的吸收，當(dāng)XOS含量過高時(shí)，其發(fā)酵產(chǎn)生的酸性物質(zhì)降低了pH，腸道pH過低后有益菌無法繁殖，菌群結(jié)構(gòu)平衡被打破，腸道吸收力下降，下調(diào)了PepT1基因表達(dá)量及對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[36]。

4 結(jié)論

1)飼料中添加低聚木糖(0.75%、1.00%)可顯著提高虹鱒的增重率和特定生長率。

2)0.75%、1.00% 低聚木糖組的抗氧化能力和非特異性免疫能力效果最佳。

3)本試驗(yàn)條件下，三倍體虹鱒飼料中，低聚木糖的最適添加量為0.75%～1.00%。