丁若男，李楠楠，傅佳佳,2，蘇靜

(1.江南大學(xué) 江蘇省功能紡織品工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫 214122;2.江蘇陽光集團(tuán)，江蘇 江陰 214426)

沒食子酸是一種天然多酚[1]，又稱作3,4,5-三羥基苯甲酸，因其抗氧化[2]、抗炎、抑制細(xì)胞活性[3]和抗癌活性[4]而被廣泛應(yīng)用。漆酶作為一種多酚的氧化還原酶[5]，它可引發(fā)底物形成自由基，自由基之間聚合生成有色聚合物[6]。酶染作用條件溫和、環(huán)保，在生態(tài)染整方面具有一定的優(yōu)勢，也為紡織品生物染色提供思路[7]。

本文選用沒食子酸單體作為漆酶作用的底物，催化合成低聚物或高分子化合物?；谄崦复呋宇悊误w產(chǎn)生自由基進(jìn)而聚合生成有色多聚物，并通過不同的測試方法，對聚合產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行表征。因聚合產(chǎn)物顯示有色，后續(xù)可能會(huì)用于紡織品的染色和功能整理[8-9]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

漆酶(Trameteshirsuta)，實(shí)驗(yàn)室自制；沒食子酸(GA)、2，2-聯(lián)氮二(3-乙基苯并噻唑)二胺鹽(ABTS)、醋酸鈉、醋酸、2，5-二羥基苯甲酸、KBr粉末、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純。

CP114電子天平；移液槍;Thermo Mixer微型反應(yīng)器；Synergy H1酶標(biāo)儀；SK2510 HP超聲水浴鍋;Q500熱重分析儀;Q200差示掃描量熱儀;美國Labconco FreeZone 2.5 L臺(tái)式凍干機(jī)；Microflex LT飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；Nicolet is10傅里葉變換紅外光譜儀；Bruker AduanceⅢ全數(shù)字化核磁共振波譜儀。

1.2 酶活測試

稱取ABTS固體(2.8 mg)溶解在去離子水(10 mL)中，通過檢測在420 nm處ABTS+自由基所變化的吸光度值來確定漆酶酶活。首先，選用0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH=5.0)分別制得0.5 mmol/L的ABTS溶液和濃度適宜的待測酶溶液，然后從以上兩種配制好的溶液中分別取用100 μL充分混合，迅速用酶標(biāo)儀讀取混合液吸光度值，其中參數(shù)設(shè)置：420 nm處每間隔1 min測試1次，總計(jì)10 min。1個(gè)漆酶活性單位(U)指的是：室溫條件下在1 min內(nèi)氧化能夠得到1 μmol ABTS+自由基所需的酶的總量[10]。

1.3 聚合實(shí)驗(yàn)

稱取(10 mg/mL)沒食子酸單體適量，將其溶解于10 mL醋酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=5)中，完全溶解后，加入漆酶(300 μL，100 U/mL)、羊毛織物(5 cm × 5 cm)，在40 ℃的微型反應(yīng)器中以300 r/min振蕩，引發(fā)聚合反應(yīng)。反應(yīng)過程中確保反應(yīng)液與空氣充分接觸。反應(yīng)24 h后，取出織物，水洗后置于烘箱中40 ℃烘干。剩余反應(yīng)溶液需離心、過濾，再將剩余液體經(jīng)凍干機(jī)冷凍干燥處理，最后獲得聚合產(chǎn)物粉末，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 表征測試

1.4.1 紫外-可見分光光譜分析 利用酶標(biāo)儀對聚合反應(yīng)過程中不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)溶液進(jìn)行紫外-可見吸收光譜掃描，繪制出不同時(shí)刻反應(yīng)液在230～700 nm吸光度的變化曲線。

1.4.2 FTIR紅外-吸收光譜 稱取適量待測樣品與198 mg KBr粉末混合，研磨時(shí)間1～2 min，然后壓片。利用傅里葉變換紅外光譜儀對沒食子酸單體及其反應(yīng)獲得的聚合產(chǎn)物分別進(jìn)行測試。其中參數(shù)包括掃描范圍4 000～500 cm-1，分辨率4 cm-1，次數(shù)32次。

1.4.3 核磁共振氫譜分析 將沒食子酸單體及其聚合產(chǎn)物兩個(gè)測試樣品均以20 mg/mL的濃度溶解于DMSO溶劑并置于核磁管中標(biāo)記，然后利用核磁共振波譜儀對每個(gè)樣品進(jìn)行1H NMR測試，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(TMS)。

1.4.4 MALDI-TOF飛行時(shí)間質(zhì)譜分析 將1 mg沒食子酸及其聚合反應(yīng)產(chǎn)物分別溶解在0.2 mL TA30或者0.1%TFA中，取1 μL溶解后溶液與1 μL基質(zhì)混合，取1 μL混合液點(diǎn)到樣品靶上，空氣中自然晾干，再利用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)在正離子反射模式下對樣品進(jìn)行測試。

1.4.5 游離酚羥基含量測定 使用Folin-Ciocalteu[11]分光光度法測定聚合前后的游離OH基團(tuán)總量。將溶解在DMSO(100 μL)中的單體和聚合產(chǎn)物溶液添加到Folin-Ciocalteu試劑(500 μL)和蒸餾水(6 mL)的混合物中，并將混合物振搖1 min。之后，將Na2CO3溶液(15%，2 mL)加入到混合溶液中搖動(dòng)1 min。通過添加蒸餾水將溶液補(bǔ)足至10 mL。2 h 后，在750 nm(25 ℃)下測量吸光度。

1.4.6 熱重分析 稱量5 mg待測試樣品放入鋁制坩堝中，利用熱重分析儀，設(shè)置其升溫速度10 ℃/min，由25 ℃升至600 ℃，整個(gè)測試將置于流速為60 mL/min的N2環(huán)境中。

1.4.7 差示掃描測試分析 稱取5 mg的待測樣品，將其放入DSC固體坩堝中，利用差示掃描量熱儀將法蘭溫度降至-80 ℃，進(jìn)行測試。設(shè)置其升溫速率為10 ℃/min，從40 ℃升溫至400 ℃，于流速為50 mL/min的N2氛圍中進(jìn)行測試。

1.4.8 聚合產(chǎn)物粒徑測定 將聚合產(chǎn)物溶解于合適的介質(zhì)中，在環(huán)境溫度下利用Zetasizer nano ZS分析儀對反應(yīng)所得產(chǎn)物膠束的平均粒徑大小及多分散指數(shù)進(jìn)行測試，并觀察粒徑的分布狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外-吸收光譜

由圖1可知，沒食子酸單體溶解在醋酸鹽緩沖溶液中呈無色透明狀，在260 nm紫外區(qū)由于苯環(huán)振動(dòng)存在π→π＊電子躍遷，可見光區(qū)沒有吸收峰。隨著時(shí)間的變化，反應(yīng)24 h的反應(yīng)液在380 nm左右出現(xiàn)了新的吸收峰，B帶紅移，但是漆酶的加入并沒有對反應(yīng)液紫外區(qū)吸收光譜產(chǎn)生影響，這也說明沒食子酸單體間的聚合對苯環(huán)結(jié)構(gòu)沒有影響[8]，但是反應(yīng)過后產(chǎn)物的共軛體系變大，從而產(chǎn)生了有色聚合產(chǎn)物。

圖1 反應(yīng)24 h后反應(yīng)液的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum of the reaction solution after 24 h of reaction

2.2 紅外光譜分析

對沒食子酸單體和沒食子酸聚合物的FTIR分析結(jié)果見圖2。

圖2 沒食子酸單體及其聚合產(chǎn)物紅外吸收光譜圖Fig.2 Infrared absorption spectrum of gallic acid monomer and its polymerization products

由圖2可知，沒食子酸和沒食子酸聚合產(chǎn)物的紅外吸收光譜存在明顯差異。沒食子酸單體在3 498,3 287 cm-1存在明顯的羥基(—OH)伸縮振動(dòng)吸收峰，但聚合產(chǎn)物中該波段的峰明顯減少，說明沒食子酸單體在漆酶催化作用下發(fā)生了氧化，部分酚羥基被氧化失去了氫原子。沒食子酸單體在1 607，1 539，1 428 cm-1處是苯環(huán)結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)吸收峰，同聚合產(chǎn)物對比可得，聚合產(chǎn)物在1 600～1 200 cm-1苯環(huán)的骨架振動(dòng)吸收峰發(fā)生了明顯變化，由此也表明沒食子酸單體發(fā)生了氧化聚合反應(yīng)。1 189，1 132 cm-1為C—C伸縮振動(dòng)吸收峰，可推測聚合產(chǎn)物中各重復(fù)單元是以碳鏈的形式連接的。單體曲線中865，734 cm-1分別是苯環(huán)上的相鄰氫，從框選部分可以看到，聚合物圖譜中已經(jīng)不存在，說明苯環(huán)上的部分氫參與了聚合反應(yīng)。

2.3 核磁共振氫譜分析

核磁結(jié)果表明,與沒食子酸單體相比，聚合產(chǎn)物的羥基含量明顯降低，即沒食子酸在漆酶催化氧化作用過程中，酚羥基被氧化(見圖3)?；瘜W(xué)位移δ10.5～13是—COOH的化學(xué)信號(hào)，在聚合過程中，由于空氣中含有氧氣，通過漆酶4個(gè)銅離子協(xié)同催化作用，與空氣中的氧氣接觸催化底物氧化和對氧氣的還原；δ8～9是苯環(huán)上氫鍵的信號(hào)，但是單體和聚合產(chǎn)物相比可以看出，聚合產(chǎn)物在δ8.85，δ9.28處的信號(hào)消失，說明苯環(huán)上部分氫被取代，顯示出較弱信號(hào)或無信號(hào)；δ6.5～8是苯環(huán)上酚羥基的氫的電化學(xué)信號(hào)，同上發(fā)生取代，為了進(jìn)一步測定，通過Folin-Ciocalteau方法對聚合物中游離酚羥基的含量進(jìn)行了檢測。結(jié)果見圖4，將沒食子酸底物的酚羥基含量作為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)漆酶催化后所得聚合產(chǎn)物溶液中游離酚羥基含量顯著減少，從而進(jìn)一步說明沒食子酸酶法聚合過程中酚羥基參與到氧化聚合反應(yīng)，與核磁中酚羥基化學(xué)信號(hào)減弱結(jié)果相符合。

圖3 1H NMR圖譜沒食子酸(A)，聚沒食子酸(B)Fig.3 1H NMR spectrum gallic acid(A),polygallic acid(B)

圖4 游離羥基含量測定Fig.4 Determination of free phenolic hydroxyl groups

2.4 飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

通過MALDI-TOF 測試聚合物的分子量大小及其分布，不同聚合度聚合物分子量見表1。

表1 聚合產(chǎn)物MALDI-TOF測定相對分子量Table 1 Relative molecular weights of MALDI-TOF

沒食子酸酶法聚合所得產(chǎn)物的分子量大小主要分布于300～1 500 Da，這些是代表了不同聚合程度的沒食子酸的寡聚物(即從二聚體到八聚體)，主要峰的間距為182 Da，182表示失去兩個(gè)羥基并攜帶兩個(gè)Na+。412 Da是沒食子酸二聚體，其中兩個(gè)單體的對羥基、羧基上的氫均被Na+取代[12]；質(zhì)荷比594，777，959，1 142，1 318，1 500附近的質(zhì)譜峰分別對應(yīng)的是沒食子酸的三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體和八聚體，呈現(xiàn)規(guī)律性變化，表明聚合反應(yīng)形成低聚物的多樣性。推測在自由基聚合的整個(gè)過程中，沒食子酸分子間反應(yīng)消耗了兩個(gè)酚羥基，且對位酚羥基和羧基均被取代，從而致使相鄰質(zhì)譜峰間的質(zhì)荷比差了182 Da，MALDI-TOF MS檢測為正離子反射模式，聚沒食子酸分子緩沖溶劑中鈉離子(Na+)加和，因此對應(yīng)沒食子酸中的重復(fù)單元[C7H2O3]n2Na+。

2.5 熱性能分析

見圖5(A)，沒食子酸TG曲線顯示在0～224 ℃，沒食子酸質(zhì)量基本保持恒定，當(dāng)溫度升到256 ℃時(shí)質(zhì)量損失率達(dá)到最高，約33.26%，結(jié)合DSC曲線在264 ℃出現(xiàn)明顯吸熱峰，可知，沒食子酸的分解溫度為264 ℃左右[13]，當(dāng)溫度升至348 ℃時(shí)其損失率已經(jīng)明顯超過50%，溫度升至600 ℃時(shí)質(zhì)量損失率甚至達(dá)到73%；由圖5(B)可知，聚沒食子酸的DSC曲線顯示，在100 ℃之前可能是聚合產(chǎn)物中殘余試劑揮發(fā)導(dǎo)致失重，結(jié)合TG曲線可知，當(dāng)溫度升至358 ℃時(shí)，聚沒食子酸失重速率明顯減緩，可能是聚合產(chǎn)物中低聚物先發(fā)生分解，隨著溫度的繼續(xù)升高，聚合度高的聚合物開始緩慢分解，最終溫度升至600 ℃時(shí)，質(zhì)量損失率才達(dá)到56%，此外，聚沒食子酸的分解峰稍高于沒食子酸的分解峰，由此可以推出聚合產(chǎn)物具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖5 沒食子酸(A)和聚沒食子酸(B)的DSC和TG曲線Fig.5 DSC and TG curves of gallic acid(A) and polygallic acid(B)

2.6 粒徑大小分析

通過Zeta電位儀可對聚合物溶液中粒子的大小及分布情況進(jìn)行了測試及分析。不同濃度的聚合產(chǎn)物粒徑測試結(jié)果分析如下：

漆酶催化所獲得的聚合產(chǎn)物以不同濃度溶解在水溶液中，粒徑均分布在200～300 nm范圍。低濃度聚合產(chǎn)物較高濃度聚合產(chǎn)物顯示出較小的粒徑，但分散均勻穩(wěn)定性有一定程度下降。因此，可以看出，對于同種聚合產(chǎn)物以不同濃度存在時(shí)，濃度較大的分散體系就會(huì)表現(xiàn)出粒徑尺寸較大，相反濃度小的分散體系則呈現(xiàn)較小的粒徑尺寸，分散均勻性也有所變化[14]，后續(xù)會(huì)根據(jù)應(yīng)用要求來選用合適溶解濃度。

表2 不同濃度聚合產(chǎn)物的粒徑分析Table 2 Particle size analysis of polymerproducts at different concentrations

3 結(jié)論

漆酶催化沒食子酸聚合，得到有色聚合產(chǎn)物，通過UV-Vis、紅外、核磁共振氫譜、飛行時(shí)間質(zhì)譜對沒食子酸酶法聚合產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測試、表征和分析，最終發(fā)現(xiàn)聚合產(chǎn)物其實(shí)是不同聚合程度的沒食子酸寡聚物(即從二聚體至八聚體)，從而推測出聚合產(chǎn)物可能的結(jié)構(gòu)單元，但是具體的結(jié)構(gòu)式需進(jìn)一步研究說明。其熱性能表征結(jié)果可以看出聚沒食子酸具有較好的熱穩(wěn)定性，因而可推測該聚合產(chǎn)物在酶染和功能改性中具有較好的應(yīng)用前景。漆酶催化多酚類單體生成聚合物，這是一種比較新穎、先進(jìn)的聚合物合成方法，但是由于漆酶存在重復(fù)利用率低、成本高等缺點(diǎn)，研究后續(xù)會(huì)考慮利用高能反應(yīng)器來提高漆酶的利用率，以達(dá)到更好的應(yīng)用效果，并且會(huì)對聚合物功能特性進(jìn)行進(jìn)一步研究，拓展其使用領(lǐng)域。