趙美琴，范暉，楊杰，徐海洋

1.南通大學(xué)附屬如皋醫(yī)院（如皋市人民醫(yī)院）腫瘤內(nèi)科，江蘇如皋226500；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇徐州221000

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一種常見(jiàn)的惡性侵襲性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[1]。盡管HCC 已在診斷和治療策略方面取得了一定的進(jìn)展，但通常由于發(fā)現(xiàn)較晚、易于復(fù)發(fā)和耐藥性等原因，HCC 患者的臨床預(yù)后并未得到改善[2]。探索HCC 發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，特別是遺傳和表觀遺傳的改變，有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物[3]。作為小的非編碼核糖核酸（ribonucleic acid, RNA），微RNA（micro-ribonucleic acid, miRNA）在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而導(dǎo)致信使核糖核酸（messenger RNA, mRNA）降解和翻譯抑制[4-5]。MiRNA 能調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因，并影響細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞遷移等腫瘤相關(guān)通路，在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要意義[6]。研究證實(shí)miR-449b 表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后及侵襲相關(guān)，但其對(duì)老年HCC 預(yù)后的影響尚不清楚[7]。本研究采用隊(duì)列研究的方法探討miR-449b 的表達(dá)對(duì)老年HCC 預(yù)后的影響，為老年HCC 的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013年1月—2015年1月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科接受肝癌根治性切除術(shù)治療的老年HCC 患者176 例。手術(shù)過(guò)程中獲取癌組織標(biāo)本，并迅速保存于-80℃冰箱中。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥65 歲；（2）病理確診為原發(fā)性HCC；（3）臨床資料完整；（4）患者與家屬對(duì)研究?jī)?nèi)容知情，并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）HCC 復(fù)發(fā)后手術(shù)治療者；（2）肝移植；（3）預(yù)期生存時(shí)間較短；（4）合并其他腫瘤、自身免疫病、精神疾病或嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者。176例患者年齡66～82 歲，平均（70.3±2.7）歲，其中男性141 例、女性35 例。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理編號(hào)KY20120403）。

1.2 MiR-449b 檢測(cè) 將冰凍組織標(biāo)本經(jīng)液氮研磨后加入Trizo（lInvitrogen,北京索萊寶公司）提取總RNA，離心后取上清。RNA 定量采用超微量分光光度計(jì)NanoDrop1000（美國(guó)Nanodrop 公司），以DNase 去除DNA 污染，通過(guò)Omniscript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen 205111，上海玉博生物科技有限公司）合成cDNA，用無(wú)核酸酶水以1: 20 稀釋并保存。將cDNA 0.5L、正向和反向引物0.5L 及反應(yīng)緩沖液12.5L 混合于ABI Prism7300 系統(tǒng)中。以U6 作為內(nèi)參，37℃15 min、85℃5 s 條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)。見(jiàn)表1。

1.3 隨訪方法 采用門(mén)診、電話與上門(mén)相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪，第1年每3 個(gè)月隨訪1 次，第2年每6 個(gè)月隨訪1 次，第3年起每年隨訪1 次，隨訪患者的生存狀況，隨訪日期截至2020年1月?；颊叩哪[瘤確診時(shí)間為該患者的生存起始時(shí)間，終點(diǎn)時(shí)間為死亡時(shí)間或終止觀察時(shí)間（2020年1月），總生存時(shí)間（overall survival, OS）定義為起始時(shí)間至終點(diǎn)時(shí)間。研究期間共失訪8 例，隨訪率為96%。隨訪的168 例患者中，死亡97 例。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分率表示，采用2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。通過(guò)受試者操作特征（receiver operator characteristic, ROC）曲線評(píng)估m(xù)iR-449b對(duì)HCC 預(yù)后的預(yù)測(cè)值；Kaplan-Meier 和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素生存分析，尋找影響HCC 預(yù)后的潛在危險(xiǎn)因素。將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量引入多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，分析影響老年HCC 患者預(yù)后的因素＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]，選擇性別、年齡、蔡爾德-皮尤改良（Child-Turcotte Pugh, CTP）評(píng)分、是否感染肝炎病毒、腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期等指標(biāo)進(jìn)行分析。176 例患者miR-449b表達(dá)水平為（0.37±0.06），患者中位OS 為48 個(gè)月（4～60 個(gè)月）。見(jiàn)表2。

表2 一般資料（ =176）

2.2 MiR-449b 對(duì) HCC 患者生存率的診斷價(jià)值MiR-449b 預(yù)測(cè)老年HCC 患者死亡的臨界值為0.36。當(dāng)miR-449b 為0.36 時(shí)，miR-449b 預(yù)測(cè)老年HCC 患者死亡的敏感度為72.23%，特異度為70.38%，曲線下面積（area under the curve, AUC）為 0.712（=0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 MiR-449b 預(yù)測(cè)HCC 死亡的ROC 曲線

2.3 H CC 患者生存率的單因素分析Kaplan-Meier 和Log-rank 檢驗(yàn)顯示，CTP 評(píng)分B 級(jí)、腫瘤直徑>5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和miR-449b 低表達(dá)會(huì)增加老年HCC 患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。見(jiàn)表3、圖2。

表3 HCC 患者生存率的單因素分析

2.4 HCC 患者生存率的多因素分析 將Kaplan-Meier和Log-rank 檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，結(jié)果顯示CTP評(píng)分B 級(jí)、較大腫瘤直徑>5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和miR-449b低表達(dá)是老年HCC患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（＜0.001）。見(jiàn)表4。

圖2 MiR-449b 表達(dá)與老年HCC 患者生存的相關(guān)性

表4 HCC 患者生存率的多因素分析

3 討論

HCC 是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)是HHC 的高發(fā)地區(qū)[10-11]。雖然相關(guān)臨床治療方法在不斷完善，但HCC 患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后率仍居高不下[12]。既往研究表明，早期診斷與有效的治療可顯著改善HCC 患者的預(yù)后[13]。因此，與HCC 患者相關(guān)的高特異性、敏感性生物標(biāo)志物研究亟待展開(kāi)。

MiRNA 作為重要的遺傳物質(zhì)近年來(lái)受到重視，可調(diào)控靶基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄后水平，在細(xì)胞分化、增殖和代謝等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮作用。研究顯示，miR-449b在多種腫瘤中表達(dá)異常，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。前列腺癌中miR-449b 的低水平表達(dá)與根治性前列腺切除術(shù)后生化復(fù)發(fā)相關(guān)[14]。同時(shí)，miR-449b低表達(dá)可增加非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)[15]。MiR-449b 在肺癌組織中表達(dá)水平降低，且miR-449b靶基因HDAC1 的表達(dá)水平升高[16]。上述研究均提示miR-449b 可能具有腫瘤特異性，因此研究老年HCC患者的miR-449b 表達(dá)具有一定的臨床價(jià)值。

本次研究發(fā)現(xiàn)miR-449b 預(yù)測(cè)老年HCC 患者預(yù)后的AUC 面積為0.71，敏感度為72.23%，特異度為70.38%，可見(jiàn)miR-449b 對(duì)于預(yù)測(cè)老年HCC 患者預(yù)后有一定價(jià)值。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-449b 低表達(dá)是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，miR-449b 表達(dá)降低的老年HCC 患者預(yù)后更差。此外，腫瘤直徑、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CTP評(píng)分也與老年HCC 患者預(yù)后獨(dú)立相關(guān)。這些指標(biāo)反映了患者的腫瘤分期特征和肝功能水平，其預(yù)測(cè)價(jià)值已被證實(shí)[8-9]。目前，miR-449b表達(dá)與HCC 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚不清楚。研究顯示miR-449b 的轉(zhuǎn)染抑制了細(xì)胞增殖和遷移，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并不同程度地降低了腫瘤的生長(zhǎng)速率[17]。此外，miR-449b 可直接靶向SOX4 轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，而SOX4 可編碼一種參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和HCC 轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-b 介導(dǎo)的細(xì)胞遷移[6]。

綜上所述，miR-449b 在老年HCC 癌組織中的表達(dá)上調(diào)可能參與了HCC 的發(fā)生發(fā)展，miR-449b 低表達(dá)患者預(yù)后更差。MiR-449b 可作為潛在的老年HCC治療靶點(diǎn)，而miR-449b 通過(guò)哪些分子機(jī)制作用于HCC 還有待于進(jìn)一步的研究。