蘇雨萌, 張旭婷, 特日格樂, 田敏, 尚曉蕊, 李國婧, 王瑞剛

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 植物逆境生理與分子生物學(xué)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 呼和浩特 010018)

中間錦雞兒(CaraganaintermediaKuang)是豆科錦雞兒屬荒漠多年生灌木，分布于中國西部、西北和內(nèi)蒙古的沙質(zhì)草原和荒漠地區(qū)，在固沙、保土、保水等方面發(fā)揮著重要作用，具有很高的飼用和生態(tài)價值[1]。因其具有較強(qiáng)的抗旱抗鹽能力，中間錦雞兒被認(rèn)為是闡明對非生物脅迫耐受機(jī)制的理想植物。近年來對其分子響應(yīng)機(jī)制的研究日益增多，一些轉(zhuǎn)錄因子如NAC[2]、MYB、WRKY[3]和bHLH[4]被鑒定。microRNA(miRNA)是植物體內(nèi)普遍存在的一類內(nèi)源性單鏈20～24 nt非編碼RNA，作為mRNA表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，在植物的基因調(diào)控、發(fā)育過程和應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用[5]。干旱作為重要的非生物脅迫之一，目前，針對miRNA響應(yīng)干旱脅迫研究已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆(Glycinemax)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、煙草(Nicotianatabacum)等植物中有相關(guān)報(bào)道[6-7]。miRNAs在植物適應(yīng)干旱脅迫中起著重要的作用，一些miRNA通過調(diào)節(jié)酶的代謝和與轉(zhuǎn)錄因子相互作用來適應(yīng)干旱環(huán)境[8-10]。因此，對中間錦雞兒抗旱相關(guān)miRNA的鑒定可為進(jìn)一步闡明抗旱分子機(jī)制和錦雞兒屬及豆科植物遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和干旱處理

選取同一株植物的中間錦雞兒種子，播種于營養(yǎng)土與蛭石(1:3)中，在光照16 h/黑暗8 h，晝夜溫度22～25 ℃的生長室中培養(yǎng)30 d，選取生長狀態(tài)一致的中間錦雞兒小苗，從培養(yǎng)缽中取出，盡量避免損傷和刺激，置于原培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行干燥脫水處理，處理0(對照Drought_0h)、1(Drought_1h)、3(Drought_3h)、12 h(Drought_12h)，每個時間點(diǎn)取6株植物，收集對照及脫水處理樣品地上部分(莖和葉)于液氮速凍后存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 small RNA文庫構(gòu)建和測序

用單步酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法[11]提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和完整性，并用超微量核酸蛋白分析儀定量檢測RNA的濃度。對照和干旱脅迫處理1、3、12 h后，從莖葉中得到4份sRNA樣品，取3 μg總RNA用 Balancer NGS Library Preparation Kit試劑盒(GnomeGen)構(gòu)建small RNA cDNA文庫，并送武漢ABLife科技有限公司使用Illumina GAIIx進(jìn)行測序。

1.3 miRNA分類鑒定

首先，剔除低質(zhì)量測序片段、接頭序列以及原始數(shù)據(jù)中低于16 nt的片段，獲得clean reads。然后，利用Rfam數(shù)據(jù)庫通過BLASTn搜索，獲得四份樣本的長度分布以及共有和特有的序列信息，得到rRNA、tRNA、sRNA、snRNA、lncRNA和miRNA。

讀取滿足miRNA預(yù)測原則的有效長度，然后利用BLASTn與miRBase數(shù)據(jù)庫中已知植物的miRNA進(jìn)行比對；用miRDeep2軟件預(yù)測新的miRNA前體能否形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是否具有較低的自由能MFE(minimal free energy)和較高的自由能指數(shù)MFEI(minimal free energies index)，篩選新miRNA[16]。通過比較對照和每個干旱處理中miRNA的reads讀數(shù)進(jìn)行差異分析，以P值≤0.05，差異倍數(shù)(fold change)≥1.5 或≤0.67為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)的miRNA。

1.4 miRNA靶基因預(yù)測

新預(yù)測到的miRNA與中間錦雞兒干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis?function=3.)進(jìn)行靶基因預(yù)測，并通過ATIR(ArabidopsisthalianaL, transcript, removed miRNA gene, ATIR)預(yù)測新miRNA在擬南芥中的靶基因，預(yù)測規(guī)則如下：不允許超過3堿基的錯配，互補(bǔ)長度為20 bp以上，中心錯配范圍在9～11 nt。

2 結(jié)果與分析

2.1 中間錦雞兒miRNA的深度測序與鑒定

為了鑒定干旱脅迫下中間錦雞兒抗旱相關(guān)的miRNA，構(gòu)建了對照和三種干旱處理的small RNA文庫，測序后從4個文庫中共獲得5.51、7.60、7.91和6.19 M的原始數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量測序片段，接頭序列和小于16 nt的序列，共有4.95、7.09、7.28 和5.97 M clean data(表1)，比例均在89%～96%之間。利用BLASTn將small RNA序列與Rfam數(shù)據(jù)庫比對，比對到的序列比例占14%～22%，miRNA在四個small RNA文庫含量在0.62～0.93 M，大部分有效長度為24 nt，符合miRNA的特點(diǎn)。

表1 中間錦雞兒small RNA測序及clean reads分類注釋結(jié)果

2.2 中間錦雞兒中保守的miRNA

通過比較，共鑒定到88個保守的miRNA，來源于33個miRNA家族(圖1)，MIR156家族最大，有12個成員，MIR166、MIR159 和MIR172分別有9、6和5個成員。然而，在MIR158、MIR404、MIR408、MIR832和MIR846家族只有很少的成員，不同的miRNA家族表達(dá)差異很大，MIR159 和 MIR396家族有一個非常高的表達(dá)，其中cin-miR396a 的表達(dá)量在對照組高達(dá)535 725 reads。

圖1 保守miRNA家族成員數(shù)量

2.3 中間錦雞兒中新的miRNA

除了鑒定中間錦雞兒中保守的miRNA，遵循植物miRNA的注釋標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出28個新的miRNA(表2)，他們的前體序列能形成二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)，MFE值在-58.40～-19.88 kcal·mol-1之間，MFEI值0.68～1.79，新miRNA的表達(dá)量較保守miRNA低(圖2)，cin-novel-25的表達(dá)量最高，在對照組中也僅有1 952 reads。表明中間錦雞兒中的miRNA大多是保守的，且家族成員分布與其他報(bào)道物種一致，保守的較新的miRNA表達(dá)量高。

圖2 中間錦雞兒中新miRNA表達(dá)量

表2 中間錦雞中的新miRNA

28個新miRNA的聚類表達(dá)譜如圖3所示，結(jié)果表明，每個miRNA在生物學(xué)特性之間具有相似性，干旱處理12 h在一個分支上，與對照相比，1和3 h干旱脅迫處理具有更多的差異表達(dá)miRNA，推測干旱處理12 h是中間錦雞兒干旱響應(yīng)的極值。干旱處理1和3 h在同一分支上，這兩個實(shí)驗(yàn)組有較多的相同表達(dá)的miRNA。28個新miRNA被分為3組，其中cin-novel-25、cin-novel-3、cin-novel-2和cin-novel-5在前兩組，這4個miRNA在對照組和3個干旱處理組中的表達(dá)最高，在第三組是表達(dá)量相對較低的一些miRNA，cin-novel-26在干旱脅迫處理3 h時表達(dá)水平顯著高于其他處理，而在對照、干旱脅迫處理1和12 h的表達(dá)水平極低。

圖3 28個新miRNA在對照和干旱處理中的表達(dá)量

2.4 中間錦雞兒干旱條件下差異表達(dá)的miRNA

為了鑒別差異表達(dá)的miRNA，以P≤0.05和fold change≥1.5或≤0.67為標(biāo)準(zhǔn)，比較三種干旱處理與對照組miRNA表達(dá)水平的差異(表3)。與對照相比，干旱處理3 h差異表達(dá)的miRNA最多，包括7個下調(diào)表達(dá)和10個上調(diào)表達(dá)的，共17個miRNA；cin-miR164a、cin-miR164b、cin-miR168a、cin-miR168b在干旱脅迫處理中與對照相比下調(diào)表達(dá)；cin-novel-3、cin-novel-11、cin-novel-21在干旱脅迫處理1和3 h中均上調(diào)表達(dá)。表明脫水干旱處理3 h差異表達(dá)的miRNA較多，cin-novel-26表達(dá)量在脫水干旱處理3 h達(dá)到極值，推測參與調(diào)控較多，可以作為下一步研究的重點(diǎn)。

表3 差異表達(dá)的miRNA

2.5 中間錦雞兒中miRNA靶基因的預(yù)測

用psRNATarget預(yù)測中間錦雞兒miRNA的靶基因，28個新miRNA在中間錦雞兒中共預(yù)測到582個靶基因。miRNA與靶基因的作用方式都是一對多的，其中cin-novel-28預(yù)測到的靶基因最少，僅有三個；而cin-novel-2預(yù)測到了68個靶基因。miRNA與靶基因的作用方式大多數(shù)是直接介導(dǎo)靶基因的降解，只有少數(shù)是抑制靶基因的翻譯，其中cin-novel-27，cin-novel-10和cin-novel-2與靶基因堿基完全互補(bǔ)。28個新miRNA在擬南芥中共預(yù)測到212個靶基因，這些靶基因包括SPL蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、泛素、PPR家族蛋白、生長素應(yīng)答因子等，且大多數(shù)參與干旱脅迫應(yīng)答；但cin-novel-11、cin-novel-18和 cin-novel-20 在擬南芥中沒有預(yù)測到靶基因，推測這與miRNA的物種特異性和非保守性有關(guān)。

3 討論

miRNAs在植物對干旱脅迫的適應(yīng)中起著重要作用。近年來，高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物miRNAs的鑒定。中間錦雞兒是一種多年生荒漠灌木，對非生物脅迫有著較為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。很少有對中間錦雞兒抗旱相關(guān) miRNAs的調(diào)查報(bào)道。2017年，Ning等[12]采用高通量測序技術(shù)，在干旱脅迫下對檸條中490個保守miRNAs和96個新miRNAs進(jìn)行了鑒定，在鹽脅迫下通過高通量測序在中間錦雞兒中鑒定出132個保守的miRNAs和10個新的miRNAs。本研究通過solexa高通量測序和生物信息學(xué)分析，在中間錦雞兒中預(yù)測了88個保守miRNA和26個新miRNA，其中cin-miR164a、cin-miR164b、cin-miR168a、cin-miR168b在干旱脅迫下表達(dá)下調(diào)。cin-novel-3、cin-novel-11、cin-novel-21在干旱脅迫處理1和3 h后均較對照組上調(diào)，cin-novel-26在3 h干旱脅迫處理中有特異性表達(dá)。這些結(jié)果表明，脫水干旱處理3 h是有效的干旱處理，為以后的中間錦雞兒的干旱處理提供了依據(jù)。

miRNA的重要研究價值體現(xiàn)在對靶基因表達(dá)的調(diào)控。在植物中，大多數(shù)miRNA和靶基因的作用方式是完全堿基配對的，miRNA參與調(diào)控靶基因介導(dǎo)的分裂[13]。由于miRNA靶基因的數(shù)量龐大，在線軟件被廣泛應(yīng)用于植物miRNA靶基因的預(yù)測，psRNATarget是應(yīng)用最廣泛的軟件。以鷹嘴豆為例，共鑒定出122個保守的miRNAs和59個新的miRNAs，用psRNATarget預(yù)測了358個靶基因[14]。本研究利用psRNATarget數(shù)據(jù)庫預(yù)測了28個新的中間錦雞兒的miRNA，其中中間錦雞兒靶基因582個，擬南芥靶基因212個。其中cin-miR164a和cin-miR164b是ABA依賴的干旱脅迫NAC轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)的靶基因，與擬南芥和水稻[15]中的相同。但由于物種的特異性，一些miRNA并沒有預(yù)測到靶基因，這需要深入研究驗(yàn)證。