程 旭，楊雨晴，吳賽男，侯勤龍，2，李詠梅，2，韓慧明，2

(1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院感染與免疫研究中心，吉林 吉林 132013)

生物膜是細(xì)菌在宿主體內(nèi)生存的一種形式[1]，細(xì)菌生物膜的形成是導(dǎo)致長期感染的主要致病機(jī)制[2].有研究[3-4]表明：由金黃色葡萄球菌(金葡菌)導(dǎo)致的細(xì)菌生物膜感染逐年增多，而金葡菌生物膜的形成過程十分復(fù)雜，受眾多基因及因子的共同調(diào)控[5].金葡菌生物膜的主要成分有多糖PIA(polysaccharide intercellular adhesion)、細(xì)菌表面分泌的細(xì)菌蛋白以及細(xì)胞外DNA[6].

在金葡菌中主要存在2類調(diào)控系統(tǒng)：一類是雙組分調(diào)控系統(tǒng)(Two component regulatory system，TCRS)[7]，另一類是葡萄球菌附屬蛋白調(diào)控系統(tǒng)(SarA 蛋白家族類，Stapphylococcal accessory protein regulator)[8].SarA是SarA蛋白家族的第一個成員，該家族包括已經(jīng)研究較為清楚的SarA、SarR、SarS、SarT、SarU以及功能尚不明確的SarV、SarX、SarY 和 SarZ[9].SarA是一種二聚體DNA結(jié)合蛋白，可與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合后發(fā)揮調(diào)控作用.有研究[10]發(fā)現(xiàn)：它在毒力基因調(diào)控系統(tǒng)中具有至關(guān)重要的作用，直接或間接調(diào)控的基因有120個，其中76個基因表達(dá)上調(diào)，44個基因表達(dá)下調(diào).SarA不僅可以促進(jìn)ica(intercellular adhesin locus)的轉(zhuǎn)錄，還能在不含有ica操縱子的條件下促進(jìn)agr(accessory gene regulator)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的表達(dá)，而agr系統(tǒng)可以減弱金葡菌形成生物膜的能力，所以，SarA可以影響生物膜的形成[6].除此之外，SarA還可以通過調(diào)節(jié)生物膜相關(guān)蛋白及纖連蛋白結(jié)合蛋白等表達(dá)，同樣使細(xì)菌生物膜的形成能力減弱[11-12]，目前，已研究出針對SarA設(shè)計的生物膜抑制劑[3，13].

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金黃色葡萄球菌菌種(ATCC 6538，中國普通微生物菌種保藏管理中心保存)；質(zhì)粒pET32a(+)(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗室保存)；大腸桿菌DH5α感受態(tài)(索萊寶生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉(Oxoid公司，英國)、氨芐西林(100 mg/mL)、卡那霉素(50 mg/mL)、基因組小提試劑盒、IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、弗氏(不)完全佐劑、限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI(碧云天生物技術(shù)有限公司)；凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)；pEGM-T(promega)、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(ABclonal，美國).

1.2 試驗方法

1.2.1 SarA蛋白序列分析

通過NCBI獲取SarA(Genbank：AAB21606.1)基因序列，采用TMHMM Server V2.0軟件分析SarA蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；應(yīng)用抗原決定簇預(yù)測軟件分析SarA蛋白的抗原表位.

1.2.2 引物設(shè)計

通過分析目的基因以及原核表達(dá)載體序列，選擇共有的BamH I、XhoI作為酶切位點，在目的基因的上下游分別加上BamH I、XhoI酶切位點及保護(hù)性堿基，引物序列見表1.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 PCR擴(kuò)增并回收目的片段與T載體連接

將金葡菌ATCC 6538菌株進(jìn)行菌種復(fù)蘇，用基因組小提試劑盒進(jìn)行金葡菌基因組提取，以基因組為模板，用P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段SarA.擴(kuò)增體系見表2.反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 30 s，42.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s，10個循環(huán)；95 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，20個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min.

表2 SarA基因擴(kuò)增體系Tab.2 SarA gene amplification system

吸取1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確的目的片段加A尾，每50 μL體系加5.0 μL dNTP、5.0 μL 10×Taq buffer、2.0 μL Taq酶，95 ℃ 2 min，72 ℃ 30 min.將已加A尾的目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙啶顯色并切膠后，用天根膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.按照pGEM-T Vector說明書將SarA純化產(chǎn)物與pGEM-T進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH 5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于氨芐平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h.

1.2.4 T載體重組質(zhì)粒連接、菌液PCR及雙酶切鑒定

挑取多個白色單克隆，置于200 μL含有氨芐的抗菌藥物液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min過夜，震蕩培養(yǎng).次日，吸取2 μL菌液作為模板，進(jìn)行菌液PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2.3.若菌液PCR鑒定為陽性，則吸取5 μL相應(yīng)陽性菌液，置于5 mL 含有5 μL氨芐抗菌藥物的液體LB中，37 ℃ 200 r/min過夜震蕩培養(yǎng).次日，用Omega質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，37 ℃酶切4 h，凝膠電泳鑒定.最后將酶切正確的質(zhì)粒菌液進(jìn)行測序.

1.3 SarA-pET32a(+)原核表達(dá)載體的構(gòu)建及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

1.3.1 SarA-pET32a(+)原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將方法1.2.4測序正確的SarA-T質(zhì)粒與pET32a(+)質(zhì)粒分別用BamH I、XhoI雙酶切，行瓊脂糖凝膠電泳，對SarA基因片段與pET32a(+)載體片段進(jìn)行回收、純化，16 ℃ 過夜連接.連接完成后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)中，涂布于卡那霉素抗性平板上，37 ℃ 過夜培養(yǎng).次日，挑取陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定和酶切鑒定，方法同1.2.4.

1.3.2 IPTG誘導(dǎo)蛋白原核表達(dá)及蛋白純化

將SarA-pET32a(+)轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)中，涂布于含氨芐抗菌藥物的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16～18 h.挑取單克隆接種至10 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，180 r/min過夜震蕩.次日，將10 mL菌液于1 L LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃搖床，200 r/min，當(dāng)OD600達(dá)到0.5時，向1 L菌液中加入1 mL IPTG(終濃度為1 mmol)，16 ℃搖床，130 r/min過夜誘導(dǎo).次日，4 ℃ 4 500 r/min離心10 min，棄去上清，將菌液沉淀置于冰上，加入Binding Buffer和PMSF混合液進(jìn)行超聲.超聲后，4 500 r/min離心25 min，將上清與沉淀分離，再用Binding Buffer和PMSF混合液重懸沉淀；再次超聲、離心，將上清液混合.取上清與沉淀，行SDS-PAGE檢測.利用親和層析法純化蛋白，分別用100、200、300、400、500 mmol咪唑洗脫，最后選擇500 mmol咪唑進(jìn)行洗脫，將超濾濃縮管濃縮洗脫下來的蛋白樣品應(yīng)用BCA試劑盒檢測其蛋白濃度，用于多克隆抗體制備.

1.3.3 多克隆抗體的制備、血清效價及Western blot鑒定

首次免疫：將免疫原SarA重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合，選擇家兔脊柱兩側(cè)共10個位點，每個位點注射0.2 mL蛋白濃縮液(800 μg/次).3周后加強(qiáng)免疫，免疫原與弗氏不完全佐劑1∶1混合，免疫原的量是首次免疫量的50%(400 μg/次)，加強(qiáng)免疫3次.末次免疫1周后頸動脈取血，收集血清，進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(間接ELISA)，檢測血清抗體效價.以SarA純化蛋白為抗原，12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，將目的條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶孵育1 h，兔免疫血清為一抗，4 ℃過夜孵育，HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體為二抗，室溫孵育1 h，并行Western blot鑒定.

2 結(jié) 果

2.1 SarA蛋白序列分析

SarA基因編碼113個氨基酸，蛋白分子量為13.44 kDa，以二聚體形式存在，通過生物信息學(xué)軟件對SarA蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域和抗原表位分析.見圖1a.SarA基因編碼的蛋白區(qū)域均位于transme- mbrane線以下，未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域，為胞內(nèi)蛋白，可以選取基因全長的片段進(jìn)行表達(dá).見圖1b.該抗原決定簇預(yù)測軟件集成了以下5種算法：Kolaskar & Tongaonkar：分析蛋白的抗原指數(shù)；Parker：親水性預(yù)測；Chou-Fasman：蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；Karplus & Schulz：柔韌性預(yù)測；Emini：表面可及性預(yù)測.綜合以上5種算法，結(jié)果顯示后四者均有大部分重疊，而抗原指數(shù)預(yù)測與其相反，易形成抗原表位.本研究結(jié)果表明：選擇SarA作為目標(biāo)蛋白，其具有較強(qiáng)的免疫原性，容易刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，故以其為模板構(gòu)建DAN疫苗具有較強(qiáng)的可行性.

圖1SarA基因編碼蛋白的跨膜及抗原表位分析Fig.1Transmembrane and epitope analysis of protein encoded by SarA gene

2.2 目的基因片段的獲取

金葡菌菌種復(fù)蘇后，進(jìn)行基因組DNA提取，以此為模板擴(kuò)增出目的基因片段SarA(342 bp)，條帶在正確位置.見圖2.

M.DL2000；1.SarA基因.圖2SarA基因PCR結(jié)果Fig.2SarA gene PCR result

2.3 目的基因的T載體克隆、鑒定及測序

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物SarA回收，回收后與T載體連接，連接后進(jìn)行菌液PCR鑒定，PCR結(jié)果可見克隆條帶與以基因組為模板的陽性對照條帶大小一致.見圖3.

M.DL2000；1.陰性對照；2.陽性對照；3～6.SarA-T陽性克隆.圖3SarA-T重組質(zhì)粒菌液PCR結(jié)果Fig.3PCR result of SarA-T recombinant plasmid

選擇菌液PCR鑒定為陽性克隆的樣品各兩個，進(jìn)行搖菌，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒分別用BamH I和XhoI內(nèi)切酶雙酶切鑒定.酶切后分別有兩條條帶，一條為T載體條帶，一條為目的條帶.見圖4.選取的菌液行PCR鑒定以及質(zhì)粒雙酶切鑒定，結(jié)果均為陽性.將菌液送于上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，通過比對，結(jié)果與Genbank中SarA序列一致.

M.DL2000；1、3.SarA-T未酶切質(zhì)粒；2、4.SarA-T 雙酶切質(zhì)粒陽性結(jié)果.圖4SarA-T重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.4Identification results of SarA-T recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.4 SarA-pET32a(+)原核重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將測序正確的SarA-T質(zhì)粒和pET32a(+)質(zhì)粒用BamH I/XhoI內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收目的片段SarA，分別與酶切后的pET32a(+)質(zhì)粒載體連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，進(jìn)行雙酶切鑒定.見圖5.第2、4泳道上為pET 32a(+)載體條帶，下為目的條帶.

M.DL2000；1、3.SarA-pET32a(+)未酶切質(zhì)粒；2、4.SarA-pET32a(+) 雙酶切質(zhì)粒陽性結(jié)果.圖5SarA-pET32a(+)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.5Identification results of SarA-pET32a(+) recom- binant plasmid by double enzyme digestions

2.5 SarA蛋白的原核表達(dá)

將鑒定正確的SarA-pET32a(+)原核重組質(zhì)粒進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖6.SarA蛋白在16 ℃誘導(dǎo)(相較于37 ℃誘導(dǎo))條件下可溶性蛋白表達(dá)量更高.SarA的理論分子量約為14 kDa，正常條件下以二聚體形式表達(dá)，SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)分子量在32 kDa左右.由于SarA蛋白與pET32a(+)原核表達(dá)載體形成融合蛋白，pET32a(+)T7啟動子后含有一個thrombin位點、6×His標(biāo)簽、TrXA位點、Ek位點和S標(biāo)簽.

M.蛋白分子量；1.SarA重組菌體未誘導(dǎo)(37 ℃)；2.SarA重組菌體誘導(dǎo)(37 ℃)；3.SarA重組菌體的裂解液上清(37 ℃)；4.SarA重組菌體的裂解液沉淀(37 ℃)；5.SarA重組菌體未誘導(dǎo)(16 ℃)；6.SarA重組菌體誘導(dǎo)(16 ℃)；7.SarA重組菌體的裂解液上清(16 ℃)；8.SarA重組菌體的裂解液沉淀(16 ℃)；9.BL21菌體(37 ℃).圖6SarA-pET32a(+) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE分析Fig.6SDS-PAGE analysis of SarA-pET32a (+) IPTG-induced expression products

為進(jìn)行多克隆抗體的制備，利用鎳柱親和層析法純化16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的SarA可溶性蛋白，分別用100、200、300、400 mmol和500 mmol咪唑洗脫.相同條件下，500 mmol咪唑洗脫的蛋白量最多，將洗脫的蛋白樣品使用10 kDa超濾濃縮管濃縮，濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，用于多克隆抗體制備.見圖7.

M. 蛋白分子量；1. 100 mmol咪唑洗脫液；2. 200 mmol咪唑洗脫液；3. 300 mmol咪唑洗脫液；4. 400 mmol咪唑洗脫液；5. 500 mmol咪唑洗脫液.圖7SarA蛋白咪唑濃度梯度純化結(jié)果Fig.7Results of SarA protein purified by different imidazole concentrations

2.6 ELISA間接法檢測血清抗體效價

按一定比例的包被液稀釋抗原SarA蛋白濃度至10 μg/mL，家兔陰性血清做對照，將待檢血清按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、…、1∶512 000稀釋作為一抗，二抗為HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶5 000)，加TMB底物顯藍(lán)色，37 ℃孵育10 min后加入終止液，顏色變黃后應(yīng)用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖8可見血清抗體效價達(dá)到1∶512 000.

圖8免疫動物血清抗體效價Fig.8Serum antibody titer of immunized animals

2.7 多克隆抗體的Western blot鑒定

免疫后的家兔頸動脈取血，收集血清，并作為一抗(1∶2 000)；以未注射SarA蛋白的家兔血清作為陰性對照，HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體為二抗(1∶3 000).Western blot鑒定結(jié)果顯示陰性對照無任何條帶，在34 kDa位置附近能顯示出特異SarA蛋白條帶，說明本實驗已成功制備了良好特異性的SarA蛋白血清多克隆抗體.見圖9.

M.預(yù)染低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1.兔免疫血清；2.陰性血清.圖9兔血清抗體Western blot檢測Fig.9Western blot results of rabbit serum

3 結(jié) 論

細(xì)菌生物膜可引起嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，進(jìn)而形成難治性感染，細(xì)菌生物膜作為細(xì)菌耐藥的重要機(jī)制之一已引起廣泛關(guān)注，成為近年來細(xì)菌耐藥機(jī)制研究的熱點.雖然關(guān)于生物膜的形成機(jī)制已有很多研究，也認(rèn)識一些在這一過程中起作用的關(guān)鍵基因，但對于如何有效抑制生物膜形成的細(xì)節(jié)還缺乏更深入的研究[14].

有研究[15]發(fā)現(xiàn)：在金葡菌中，特異性敲除SarA基因可使細(xì)菌生物膜形成的能力減弱，且增加了金葡菌對抗菌藥物敏感性，這表明SarA在細(xì)菌生物膜的形成過程中具有至關(guān)重要的作用.本研究將SarA基因作為靶基因，通過對SarA的跨膜結(jié)構(gòu)域以及抗原表位的生物信息學(xué)分析及預(yù)測，可知SarA蛋白不具有跨膜區(qū)域，二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和β折疊組成.在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的間隙存在容易形成抗原表位的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲區(qū)域，且該蛋白的C端具有較好的柔性、親水性(≥0.5)和表面可及性(≥1)，抗原指數(shù)也較高，分布較均勻，易形成抗原表位，與抗體結(jié)合的可能性較大.

本實驗成功構(gòu)建了金葡菌SarA基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌細(xì)胞中呈可溶性表達(dá)，通過對其誘導(dǎo)溫度的改變，得到誘導(dǎo)溫度為16 ℃時，包涵體蛋白較37 ℃時減少，可溶性蛋白量增加，這可能是由于低溫會降低蛋白質(zhì)的表達(dá)速度，并促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊[16].誘導(dǎo)SarA融合蛋白，并應(yīng)用6xHis親和層析技術(shù)獲得較高純度的免疫原，免疫原結(jié)合弗氏(不)完全佐劑免疫家兔后，弗氏佐劑不僅可以使抗原持續(xù)緩慢的釋放，又能非特異性地增強(qiáng)機(jī)體對抗原的特異性免疫應(yīng)答.本實驗結(jié)果表明：研究中所表達(dá)純化的可溶性SarA蛋白具有極強(qiáng)的免疫原性，通過間接ELISA實驗和Western blot實驗得到了高效價和良好特異性的多克隆抗體.

綜上所述，SarA作為目標(biāo)蛋白構(gòu)建DAN疫苗具有可行性，可能會有效刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫.本研究為后續(xù)針對細(xì)菌生物膜消散的DNA疫苗研究奠定了基礎(chǔ)，將對具有強(qiáng)耐藥性的金葡菌感染的治療提供臨床參考價值.

致謝：本文是北華大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(201811923138)研究成果的一部分，口腔醫(yī)學(xué)院2017級田磊同學(xué)參加了本實驗的研究工作.