葛俊宏，許夢(mèng)然，王迦琦，高婧雯，侯俊宇，李明慧，李 坦，，申 野，，孫 新，

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林省分子老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013； 3.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

人參為多年生草本植物，具有天然的食用及藥用價(jià)值，在《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》中均有記載[1-2].人參中包含皂苷、糖類、氨基酸、維生素、多肽、有機(jī)酸等多種化學(xué)成分，其中人參多糖(Ginseng Polys- accharide)作為其主要活性成分，發(fā)揮著重要的藥效活性作用[3-5].20世紀(jì)60年代，SOLOV’EVA等[6]從人參根中分離出了果膠，發(fā)現(xiàn)其主要是由多糖組成，又有研究[7]發(fā)現(xiàn)人參多糖在抗氧化方面作用顯著.人參多糖的提取方法常用的有超聲輔助法、水提醇沉法等.超聲輔助法容易使植物組織破壁或變形，從而導(dǎo)致多糖活性成分減少[8]；水提醇沉法操作簡(jiǎn)單、安全，不易破壞多糖的活性成分[9].因此，本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交分解法優(yōu)化人參多糖提取工藝，并利用FRAP法、DPPH法及羥自由基法測(cè)定人參多糖的體外抗氧化活性[10]，為人參多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材 料

人參的干燥根及根莖(長(zhǎng)白山特色植物種植基地)；水溶性維生素 E(Sigma 公司，美國(guó))；乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；氯仿(天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；正丁醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma公司，美國(guó))；FRAP總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；羥自由基試劑盒(南京建成生物科技有限公司).

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀(Beckman，美國(guó))；EZ臺(tái)式凍干機(jī)(SIM公司，美國(guó))；KQ-250E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TDL-5-R低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；MDF-U4086S -80 ℃超低溫冰箱(SANYO公司，日本).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 人參多糖的提取流程

稱取適量的人參，在適當(dāng)?shù)奶崛囟取⑻崛r(shí)間、料液比、提取次數(shù)的條件下，加適量的蒸餾水浸泡、煎煮，濃縮至一定體積后，緩慢加入4倍量的95%乙醇，常溫靜置4 h，3 800 r/min離心；棄去上清液，沉淀物依次用95%乙醇、無水乙醇及乙醚梯度洗脫，真空干燥后得到人參粗多糖.將人參粗多糖水溶液置于-80 ℃冰箱靜置過夜，次日取出室溫溶解，12 000 r/min離心[11]，收集上清，反復(fù)凍融至無沉淀產(chǎn)生.按V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1配置Sevage工作液，取上述多糖溶液與Sevage工作液按1∶4混合，使用振蕩器震蕩1 h，4 000 r/min離心，取上清，重復(fù)Sevage過程，直至沒有變性蛋白出現(xiàn).把多糖溶液轉(zhuǎn)入3 500 Da[12-13]的透析袋中，置于流水下24 h，最后將透析后的多糖溶液置于凍干機(jī)中凍干，即得到人參多糖.多糖得率的計(jì)算公式：

多糖得率=m多糖/m人參×100%，

式中：m多糖為提取出的人參多糖的質(zhì)量(g)；m人參為人參原材料質(zhì)量(g).

1.3.2 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)分別選取提取溫度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)作為因素變量，按照上述多糖的提取工藝，探討4個(gè)因素3個(gè)水平對(duì)多糖得率的影響.

1)不同提取溫度對(duì)人參多糖得率的影響：在料液比m(g)∶V(mL)=1∶30、提取次數(shù)2次、提取時(shí)間60 min時(shí)，設(shè)定不同的提取溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)，考察提取溫度對(duì)人參多糖得率的影響.

2)不同料液比對(duì)人參多糖得率的影響：提取溫度60 ℃、提取次數(shù)2次、提取時(shí)間60 min時(shí)，設(shè)定不同的料液比[m(g)∶V(mL)=1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60]，考察料液比對(duì)人參多糖得率的影響.

3)不同提取時(shí)間對(duì)人參多糖得率的影響：在提取溫度60 ℃、料液比m(g)∶V(mL)=1∶30、提取次數(shù)2次時(shí)，設(shè)定不同的提取時(shí)間(20、30、40、50、60、70 min)，考察提取時(shí)間對(duì)人參多糖得率的影響.

4)不同提取次數(shù)對(duì)人參多糖得率的影響：在提取溫度60 ℃、料液比m(g)∶V(mL)=1∶30、提取時(shí)間60 min時(shí)，設(shè)定不同的提取次數(shù)(1、2、3、4次)，考察提取次數(shù)對(duì)人參多糖得率的影響.

1.3.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)初步確定提取參數(shù)變量范圍后，以此試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，見表1.

表1 因素水平L9(34)

1.4 人參多糖的體外抗氧化活性

1.4.1 人參多糖對(duì)FRAP的總抗氧化能力

使用TPTZ稀釋液、TPTZ溶液和檢測(cè)緩沖液配置FRAP工作液.稱取27.8 mg的FeSO4·7H2O，溶解并定容到1 mL，此時(shí)濃度為100 mmol/L.取100 mmol/L FeSO4溶液稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L，向96孔板內(nèi)每孔加入180 μL FRAP工作液和5 μL不同濃度FeSO4溶液，做標(biāo)準(zhǔn)曲線.將人參多糖和水溶性維生素E分別稀釋至不同濃度(25～800 μg/mL)，設(shè)置空白組和試驗(yàn)組.空白組：向96孔板內(nèi)加180 μL FRAP工作液和5 μL蒸餾水；試驗(yàn)組：向96孔板內(nèi)每孔加入180 μL FRAP工作液和5 μL不同濃度的人參多糖或水溶性維生素E.37 ℃孵育5 min后，在593 nm處測(cè)定其吸光度值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)水溶性維生素E和人參多糖的總抗氧化能力[14].

1.4.2 人參多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

配置(25～800 μg/mL)不同濃度的水溶性維生素E和人參多糖，取無水乙醇和DPPH 粉末配制 2×10-4mol/L的DPPH 溶液.設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組.空白組：向96孔內(nèi)加100 μL蒸餾水和100 μL DPPH溶液.對(duì)照組：向96孔板內(nèi)加100 μL不同濃度的人參多糖或水溶性維生素E，每孔再加入100 μL蒸餾水；試驗(yàn)組：向96孔板內(nèi)加100 μL不同濃度的人參多糖或水溶性維生素E，每孔再加入100 μL DPPH溶液.震蕩混勻，靜置30 min，測(cè)其在510 nm處的吸光度值.根據(jù)下式計(jì)算人參多糖和水溶性維生素E的清除率[15]：

清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%，

式中：A0為DPPH加水測(cè)得的吸光度；A1為不同濃度的多糖或水溶性維生素E加DPPH測(cè)得的吸光度；A2為水的吸光度.

1.4.3 人參多糖對(duì)羥自由基的清除能力

配置1～6 mg/mL不同濃度的水溶性維生素E和人參多糖，再依次配置濃度為6 mmol/L的硫酸亞鐵、水楊酸和過氧化氫溶液.設(shè)置空白組、對(duì)照組和試驗(yàn)組.空白組：向96孔板中加入50 μL蒸餾水，再加入50 μL硫酸亞鐵、50 μL水楊酸及50 μL過氧化氫；對(duì)照組：向96孔板中加入 50 μL不同濃度人參多糖或水溶性維生素E，每孔再分別加入50 μL硫酸亞鐵、50 μL蒸餾水及50 μL過氧化氫；試驗(yàn)組：向96孔板中加入50 μL不同濃度的人參多糖或水溶性維生素E，每孔再分別加入50 μL 硫酸亞鐵、50 μL水楊酸以及50 μL過氧化氫.搖勻，靜置30 min，測(cè)其在510 nm處吸光度值.根據(jù)下式計(jì)算人參多糖和維生素E的清除率[16]：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%，

式中：A0為空白組的吸光度；A1為試驗(yàn)組的吸光度；A2為對(duì)照組的吸光度.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度

提取溫度選擇30～80 ℃，隨著提取溫度的升高，多糖得率也隨之升高，當(dāng)溫度升高至60 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到(9.73±0.46)%；但當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，多糖得率卻出現(xiàn)了下降的趨勢(shì).由于溫度對(duì)分子運(yùn)動(dòng)的速度有所影響，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，多糖更容易浸出，而過高的溫度會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖含量降低[17].因此，人參多糖提取溫度選擇在50～70 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn).見圖1.

2.1.2 料液比

料液比選擇m(g)∶V(mL)=1∶10～1∶60，隨著料液比的升高，多糖得率也隨之升高，當(dāng)料液比升高到30 g/mL時(shí)，多糖得率達(dá)到(8.95±0.15)%；但當(dāng)料液比超過30 g/mL時(shí)，多糖得率卻出現(xiàn)了下降的趨勢(shì).由于隨著液體比例的增加，影響了溶劑間的熱傳遞，不利于多糖的浸出，而過低的料液比使溶液黏度大，活性成分不易擴(kuò)散，導(dǎo)致得率低[18].因此，料液比m(g)∶V(mL)選擇1∶20～1∶40 進(jìn)行正交試驗(yàn).見圖2.

圖1提取溫度對(duì)人參多糖得率的影響Fig.1Effect of extraction temperature on the yieldof Ginseng polysaccharides圖2料液比對(duì)人參多糖得率的影響Fig.2Effect of material-liquid ration on the yieldof Ginseng polysaccharides

2.1.3 提取時(shí)間

提取時(shí)間選擇20～70 min，隨著提取時(shí)間的增加，多糖得率也隨之升高，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，多糖得率達(dá)到(8.81±0.19)%；但當(dāng)提取時(shí)間超過60 min時(shí)，多糖得率卻出現(xiàn)了下降的趨勢(shì).由于提取時(shí)間較短時(shí)，多糖還沒有得到浸出，而在一定時(shí)間范圍內(nèi)，多糖得率會(huì)隨著時(shí)間的增加而升高，但超出該范圍時(shí)，其他成分會(huì)溶出過多，多糖也會(huì)因過度水解導(dǎo)致得率下降，從而影響多糖的浸出[19].因此，提取時(shí)間選擇40～60 min進(jìn)行正交試驗(yàn).見圖3.

2.1.4 提取次數(shù)

提取次數(shù)選擇1～4次，提取次數(shù)的多少對(duì)多糖得率有較大的影響，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，多糖得率達(dá)到(8.76±0.10)%；但隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率略有下降并趨于平衡，多糖無法進(jìn)一步溶解，增加提取次數(shù)對(duì)多糖得率已無明顯影響.因此，提取次數(shù)選擇2～4次進(jìn)行正交試驗(yàn).見圖4.

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)圖1～ 4單因素試驗(yàn)得到單因素下多糖得率的最佳提取條件，再考慮單因素中的幾個(gè)主要影響因素對(duì)多糖提取的影響，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝中的最佳提取條件，將最佳提取條件所得多糖得率與其他提取方案所得多糖得率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明：影響人參多糖得率的因素大小依次為提取溫度(B，R=0.763)>料液比(A，R=0.543)>提取時(shí)間(C，R=0.490)>提取次數(shù)(D，R=0.297)，在此條件下多糖提取最佳工藝條件為 A2B2C3D1，即料液比m(g)∶V(mL)=1∶30，提取溫度 60 ℃，提取時(shí)間60 min，提取次數(shù) 2次，在此條件下獲得多糖得率為(9.87±0.35)%.見表2.

圖3提取時(shí)間對(duì)人參多糖得率的影響Fig.3Effect of extraction time on the yieldof Ginseng polysaccharides圖4提取次數(shù)對(duì)人參多糖得率的影響Fig.4Effect of extraction times on the yieldof Ginseng polysaccharides

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.2 Analysis results of orthogonal test

2.3 人參多糖的體外抗氧化能力

2.3.1 總抗氧化能力

圖5人參多糖的總抗氧化能力Fig.5Total antioxidant capacity of Cinseng polysaccharides

圖6人參多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.6Scavenging ability of Ginseng polysac- charides to DPPH free radicals

圖7人參多糖對(duì)羥自由基的清除能力Fig.7Scavenging ability of Ginseng polysac- charides to hydroxyl radicals

利用FRAP檢測(cè)試劑盒對(duì)人參多糖的總抗氧化能力進(jìn)行檢測(cè)，在酸性條件下，抗氧化物可以還原Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，在593 nm處測(cè)定藍(lán)色的Fe2+-TPTZ，即可獲得人參多糖的總抗氧化能力.在50～800 μg/mL內(nèi)，人參多糖和水溶性維生素E的總抗氧化能力隨著濃度的增加而增加，人參多糖的總抗氧化能力明顯強(qiáng)于相同濃度下水溶性維生素E，且呈劑量依賴性增加.見圖5.

2.3.2 DPPH自由基的清除

因DPPH自由基有單電子，在510～520 nm處有一強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色，抗氧化劑能使單電子配對(duì)，從而使510～520 nm處吸光度值降低，溶液褪色，利用這一原理來測(cè)定人參多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力.在25～800 μg/mL內(nèi)，人參多糖和水溶性維生素E對(duì)DPPH自由基的清除能力呈劑量依賴性，人參多糖對(duì)清除DPPH自由基的能力明顯強(qiáng)于相同濃度水溶性維生素E.見圖6.

2.3.3 羥自由基的清除

過氧化氫將Fe2+氧化成Fe3+，在反應(yīng)中添加水楊酸時(shí)，能夠與—OH反應(yīng)產(chǎn)生紫色化合物，在510 nm處有較大的吸收峰，當(dāng)—OH自由基被清除時(shí)，會(huì)使有色化合物生成量減少，吸光度也隨之減小，利用這一原理測(cè)定人參多糖對(duì)—OH的清除能力.在50～800 μg/mL內(nèi)，人參多糖和水溶性維生素E對(duì)羥自由基的清除能力呈劑量依賴性增加，人參多糖清除羥自由基的能力明顯強(qiáng)于相同濃度水溶性維生素E.見圖7.

3 結(jié) 論

水提醇沉法作為常用的多糖提取方法，操作簡(jiǎn)單易行，不易破壞多糖的結(jié)構(gòu)，是多糖提取率較高的一種方法.本研究通過探討提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素對(duì)人參多糖得率的影響，利用4因素3水平正交試驗(yàn)法，確定了人參多糖的最佳提取工藝為提取溫度60 ℃、料液比m(g)∶V(mL)=1∶30、提取時(shí)間60 min和提取次數(shù)2次，在此條件下人參多糖最高得率為(9.87±0.35)%.

在正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的氧化與抗氧化處于平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，使機(jī)體傾向于氧化，自由基強(qiáng)大的傷害作用會(huì)引起機(jī)體的疾病甚至死亡，因此，尋找天然的抗氧化劑具有重要意義.有研究[20]顯示：人參多糖具有較好的體外抗氧化活性.本研究表明：人參多糖的總抗氧化能力、清除DPPH自由基和羥自由基能力顯著優(yōu)于水溶性維生素E，且在50～800 μg/mL內(nèi)呈劑量依賴性增加.

綜上，人參的主要活性成分多糖具有毒副作用小、藥理作用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，尤其在抗氧化活性方面.在未來研究中，我們將進(jìn)一步對(duì)不同方法提取的人參多糖的抗氧化能力進(jìn)行對(duì)比研究，同時(shí)對(duì)人參多糖進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性研究，為長(zhǎng)白山特色中藥人參的開發(fā)利用提供理論依據(jù).